猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立及在疫苗评价中的应用(英文)     

俞正玉  徐向伟  孙冰  何孔旺  郭容利  杜露平  温立斌  张雪寒  茅爱华  倪艳秀  李彬 《农业科学与技术》2014,(9):1487-1490

[目的]建立检测猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的TaqMan荧光定量PCR方法。[方法]根据TGEV基因组中保守的N基因序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有N基因的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。[结果]该试验建立的荧光定量PCR方法在102~1010拷贝/μl之间具有良好的线性关系,相关系数达到0.99以上,扩增效率在90%~110%之间。该方法的检测灵敏度为10拷贝,敏感性较高,而且特异性较好,与猪的其他病毒核酸均无交叉反应;批内和批间的变异系数低于3%,表明该方法的重复性较好。应用该方法可以对疫苗的免疫效力进行定量检测和评价,也可以对临床病料进行检测。[结论]该研究建立的荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,可为TGEV的流行病学调查、疫苗开发和发病机制等研究提供可靠的工具。  相似文献   

猪链球菌丝氨酸/苏氨酸激酶基因缺失株的构建及其致病性     

祝昊丹  倪艳秀  周俊明  俞正玉  茅爱华  吕立新  何孔旺 《江苏农业学报》2014,(6)

为了研究丝氨酸/苏氨酸磷激酶(STK)在猪链球菌致病过程中的作用,利用大肠杆菌-猪链球菌穿梭质粒p SET4s构建STK基因缺失株△stk。结果显示,stk基因缺失后,缺失株△stk易形成长链状结构;缺失株的半致死剂量(LD50)较亲本株高7倍,对CD1小鼠的致病能力降低;体内定植试验结果表明缺失株△stk在小鼠体内各器官的定植能力显著降低。这些数据表明STK与猪链球菌2型(SS2)的致病性相关。  相似文献   

优化致仔猪水肿病大肠杆菌培养物方法的研究   总被引：2，自引：0，他引：2  

吕立新  何孔旺  还红华  邵国青  倪艳秀  王继春  刘冬霞 《江苏农业科学》2003,(1):53-55

为摸索提高致仔猪水肿病大肠杆菌培养菌数的简单易行的方法，以普通肉汤和马丁汤为基础培养液，分别调整培养成分、通气培养和人工调节培养液的pH值，结果表明：通气培养和维持适宜的pH值能大幅度提高菌数，且马丁汤培养液明显优于普通肉汤培养液。  相似文献   

鸡新城疫病毒自然弱毒株（V4）及其耐热变种（HR）免疫原性测定     

江杰元  何孔旺等 《江苏农业科学》1992,(1):55-56

从澳大利亚引入鸡新城疫自然弱毒V4及耐热变种HR分别点眼接种免疫5日龄雏鸡，无任何临床反应，15天后攻击强毒，免疫雏鸡全部存活，对照组全部死亡，两毒株经尿囊腔接种10日龄鸡胚，96小时后仍存活，血凝抑制试验检测，免疫后7天免疫组抗体平均滴度2^4.4和2^3.7，14天抗体滴度更高，同居感染也出现抗体应答，但不能保护强毒攻击。  相似文献   

利用多重RT-PCR对口蹄疫病毒分型     

刘耀方  何孔旺  张德坤  黄炯  陆承平 《江苏农业科学》2007,(5):136-139

根据已经发表的口蹄疫病毒(FMDV)全基因序列,设计了一套引物,建立多重RT-PCR方法,区分A型、AsiaⅠ型、O型3种血清型的病毒。该方法对O型病毒的敏感性为101.00LD50,对AsiaⅠ型病毒的敏感性为101.25LD50,对A型病毒的敏感性为101.00LD50。该方法具有良好的特异性,能够区分保存适当的病料,可以用于病毒的分型。  相似文献   

PCR方法检测2型猪链球菌2种毒力因子   总被引：21，自引：4，他引：21  

何孔旺  陆承平  倪艳秀  王继春  姚火春 《扬州大学学报(农业与生命科学版)》2002,23(3):1-4

根据 2型猪链球菌毒力因子溶菌酶释放蛋白 (MRP)与细胞外蛋白因子 (EF)基因 (mrp与 epf)序列 ,分别设计、合成一对引物 ,建立聚合酶链反应 (PCR)方法。该方法扩增出 2型菌株的 mrp大小为 885 bp,epf为 62 6bp,而对马链球菌兽疫亚种 (C群 )、猪丹毒杆菌、猪肺疫巴氏杆菌、猪肺炎霉形体等 PCR均未扩增出任何条带。用 Xba 和 H ae 分别酶切 PCR扩增产物 ,均获得与预计一致的酶切图谱 ,PCR扩增产物测序结果显示 :其基因序列分别与 Gen Bank上公布的mrp全基因第 5 0 0～ 1 3 1 5位碱基及 epf全基因第 2 441～ 3 0 2 8碱基对一致。PCR检测的敏感度可达 1 0 0个细菌。用建立的 PCR对从病猪体内分离的菌株进行检测 ,检测的 1 5株 2型分离株中有 1 3株 mrp与 epf均为阳性 ,为典型的高毒力表现型菌株 (mrp epf ) ,1株为 mrp epf- ,1株为 mrp- epf- 。  相似文献   

我国牛猪轮状病毒部分分离株的亚组鉴定     

何孔旺  林继煌 《江苏农业科学》1995,(6):54-55

利用轮状病毒亚组特异性单克隆抗体进行捕捉法ＥＬＩＳＡ，对我国４株牛轮病毒分离株和４株猪轮状病毒江苏分离株进行了亚组抗原特异性鉴定，结果证实，所有被测试的牛，猪轮状病毒国内分离株，在亚组抗原特异性上均属第Ｉ亚组，未发现有属于第ＩＩ亚组的毒株。  相似文献   

一例波杂山羊葡萄球菌病与大肠杆菌病混合感染的初步诊断     

张则斌  王芳  徐为中  范志宇  何孔旺  高成华  王平生 《安徽农业科学》2007,35(36):11843-11844,11846

安徽省固镇某羊场3～4月间发生了一起疫情,部分未成年波杂山羊尤其羔羊出现连续发病和死亡。通过采取病死羊病料做病原分离鉴定,结合发病情况、临床症状、剖检病变和药物治疗结果,将该次疫情初步诊断为波杂山羊葡萄球菌病和大肠杆菌病混合感染。  相似文献   

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌转铁结合蛋白2基因克隆、序列分析及表达     

王芳  何孔旺 《农业生物技术学报》2005,13(2):175-178

参照猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniac)血清5型菌株序列ZA6774设计1对特异性引物，用PCR方法扩增转铁结合蛋白2(Tbp2)基因，得到1条1624bp的片段，然后克隆到pMD18-T载体中，经测序比较，与参考序列的核苷酸同源性达99．8％，从T-载体中切下目的片段后，定向克隆到pET32a( )中，转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，经诱导后，SDS-PAGE电泳，Tbp2高效表达，Western-blotting鉴定呈阳性。  相似文献   

肠毒素性大肠杆菌菌毛对产蛋鸡免疫性的研究   总被引：4，自引：1，他引：3  

华荣虹  张书霞  何孔旺  白文霞  张雪寒 《畜牧与兽医》2002,34(5):7-8

采用热抽提法提取4种肠毒素性大肠杆菌菌毛蛋白。K88、K99、F41和987p菌毛蛋白分别制成弗氏佐剂苗;K88还制成白油佐剂苗,氢氧化铝胶苗和蜂胶佐剂苗;另将4种菌毛等比例混合制成弗氏佐剂苗。分别对产蛋鸡进行免疫,用微量凝集反应和血凝抑制试验检测卵黄抗体效价。结果表明,K88菌毛较其他3种菌毛免疫性好,诱导抗体效价最高而且能长时间维持;987p菌毛能快速诱导抗体的产生,但整体效价低。K88不同佐剂苗中,铝胶佐剂能较快地诱导抗体的产生,蜂胶佐剂苗抗体持续时间短,弗氏佐剂能诱导高效价的抗体产生而且能长时间持续。  相似文献