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重组逆转录病毒介导的neo~R基因在公鼠生殖系细胞的转移 总被引：1，自引：0，他引：1
将感染滴度为 10 6cfu/ m L、携带新霉素磷酸转移酶 (neo R)基因的重组逆转录病毒与台盼蓝、polybrene按一定比例配制成注射液 ,单侧睾丸注入 14～ 16日龄公鼠曲细精管以体内感染精原干细胞 ,进行重组逆转录病毒 -精原干细胞介导的基因转移研究。注射后 45 d,采集公鼠精液 ,进行精液品质与 PCR检测。结果表明 ,在优化的注射条件下 ,曲细精管内注射重组逆转录病毒后 ,不会干扰小鼠精子的正常发育能力 ,并能够将外源基因整合到精子基因组 ,从而首次通过重组逆转录病毒成功地实现了 neo R基因在公鼠生殖系细胞的转移 相似文献
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为了成功克隆外膜蛋白16(outer membrane proteins 16, Omp16)基因并对其进行原核表达,试验根据GenBank中羊布鲁氏菌M5-90株外膜蛋白Omp16基因序列(登录号:JF918760.1)设计1对引物,从布鲁氏菌基因组中扩增出大小约为507 bp的目的基因片段,凝胶回收纯化目的片段,连接入pMD20-T质粒,转化E.coli DH5α并测序,测序正确后再亚克隆入pET-28a(+)表达载体,构建重组质粒pET-Omp16,转化入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导其表达,最后用Western blotting分析方法鉴定诱导得到的蛋白。结果表明,成功构建了pET-Omp16原核表达载体,并在E.coli BL21中表达了Omp16基因,诱导得到的蛋白经鉴定与目的蛋白大小一致,证明成功表达了目的基因。 相似文献
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本试验旨在克隆并表达中国荷斯坦奶牛髓样分化蛋白-2(myeloid differentiation protein -2,MD-2)基因,并用Western blotting进行鉴定。采用RT-PCR技术从中国荷斯坦奶牛外周血白细胞中扩增MD-2 cDNA,并将扩增产物与pMD20-T载体连接,重组质粒经测序鉴定后,构建pET28a-MD-2重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果表明,目的基因含有1个483 bp的开放阅读框,编码161个氨基酸;与黄牛、黑猩猩和小鼠MD-2的cDNA序列同源性分别为99.38%、77.02%、68.12%,氨基酸同源性分别为98.75%、65.00%和58.13%。融合蛋白以包涵体的形式存在,分子质量约为25 ku。说明本研究成功克隆并表达了中国荷斯坦奶牛MD-2 cDNA,为其进一步的功能研究提供了理论依据。 相似文献
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根据GenBank公布的羊布鲁氏菌(B.melitensis) M5-90株外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)基因序列,设计1对引物,以其全基因组为模板,采用PCR技术对其进行扩增,得到381 bp的目的片段,连接入pMD20-T载体,转化E.coli DH5α感受态细胞;测序正确后,构建pET-28a-Omp10原核表达质粒,再将该质粒转化入E.coli BL21(DE3), IPTG诱导表达融合蛋白His-Omp10,用SDS-PAGE和Western blotting进行分析.结果表明, 成功构建了含Omp10基因的原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了Omp10基因,诱导得到的融合蛋白经鉴定与目的蛋白大小一致,证明Omp10得到成功表达.该试验为布鲁氏菌病的进一步研究奠定基础. 相似文献
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试验旨在对类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei,B.pseudomallea）的BPSS0180基因进行克隆和原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中类鼻疽伯克霍尔德菌K96243标准株BPSS0180基因序列设计1对引物,对类鼻疽伯克霍尔德菌hn-1株进行PCR扩增获得BPSS0180基因片段。将得到的BPSS0180基因连接到pET-28a （+）载体,构建pET-28a （+）-BPSS0180重组质粒,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后,将构建成功的pET-28a （+）-BPSS0180重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。应用DNAMAN、ProtParam、SOPMA和Protscale对BPSS0180基因序列进行生物信息学分析。结果显示,本试验成功克隆了1 146 bp的BPSS0180基因,诱导表达得到的His-BPSS0180融合蛋白大小约为45 ku,且主要以包涵体形式存在。BPSS0180蛋白的分子式为C1779H2809N545O536S7,分子质量为40.6 ku,消光系数为40 575,疏水指数为85.43。其不稳定系数为46.52,属于不稳定蛋白;理论等电点（pI）为5.54,为酸性蛋白;总平均疏水性（GRAVY）是-0.261,为亲水性蛋白。该蛋白的二级结构以α-螺旋（58.79%）和无规卷曲（32.02%）为主,预测其在哺乳动物网织红细胞的半衰期为30 h。本试验结果为进一步探究类鼻疽伯克霍尔德菌的BPSS0180基因提供了一定的理论依据。 相似文献
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试验旨在对羊种布鲁氏菌dhbC基因进行克隆及原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中布鲁氏菌M5-90株dhbC基因序列信息设计1对引物,通过PCR反应扩增获得dhbC基因片段。将得到的dhbC基因连接到pMD20-T载体,构建pMD20-T-dhbC重组质粒并转化大肠杆菌（E.coli） DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建pET28a-dhbC重组质粒,转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。运用生物信息学软件DNAMAN及相关在线网站ProtParam、SOPMA及Protscale对dhbC基因编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明,试验成功克隆了大小约为1 093 bp的dhbC基因并进行了蛋白表达,表达的融合蛋白大小约为47 ku,且主要以包涵体形式存在。dhbC蛋白的分子式为C1866H2968N544O562S15,分子质量为42 496.3 u,理论等电点（pI）为5.81,消光系数为33 835,不稳定系数为36.76,疏水指数为86.19,总平均疏水性（GRAVY）为-0.215。预测在哺乳动物网织红细胞的半衰期为30 h,其二级结构以α-螺旋（41.94%）和无规则卷曲（31.46%）为主。 相似文献
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为克隆羊源类鼻疽伯克霍尔德菌BPSS1512基因,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析,以类鼻疽伯克霍尔德菌基因组为模板,参照GenBank中Burkholderia pseudomallei K96243株基因组DNA序列（登录号：NC_006351.1）设计引物,PCR扩增BPSS1512基因,构建重组质粒,SDS-PAGE和Western blotting分析其蛋白表达,DNAMAN等软件对BPSS1512基因编码的氨基酸序列进行分析。结果显示,PCR扩增成功得到1 425 bp的特异性条带,BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后得到约为5 000和1 500 bp的条带,表明重组质粒pET-28a-BPSS1512构建成功,IPTG浓度为10 mmol/L,诱导时间8 h为最适宜的诱导条件。BPSS1512基因编码的蛋白质分子质量为53 ku,在包涵体中表达;在BPSS1512蛋白二级结构中,α-螺旋、延伸链和无规卷曲分别占24.05%、14.77%、61.18%,并且疏水性区域分布在-2.0~+2.4之间,说明BPSS1512蛋白具有较强的疏水性,本试验结果可为类鼻疽病的防制提供参考依据。 相似文献
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为了探讨基因Ⅳ型戊型肝炎病毒开放阅读框3(ORF3)表达的蛋白(pORF3)影响靶细胞基质金属蛋白酶(MMP)表达的分子机制,试验运用蛋白芯片技术对比分析了稳定表达pEGFP-ORF3和pEGFP的L02细胞中基质金属蛋白酶表达谱,筛选出表达水平上调/下调的基质金属蛋白酶.结果表明,在稳定表达pEGFP-ORF3的L02细胞中,TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4表达水平均降低.本试验结果为戊型肝炎病毒pORF3对L02细胞中基质金属蛋白酶相关蛋白表达影响的分子机制研究提供了理论依据. 相似文献