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破伤风毒素C片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达 总被引：1，自引：0，他引：1
应用PCR技术直接从破伤风梭菌64008菌株基因组中扩增出1356bp的破伤风毒素C片段基因，该片段是与靶细胞起结合作用的重链C端基因，经DNA序列测定分析，扩增出的基因与GenBank上登陆的序列AFl54828的同源性达到99．2％。将此基因克隆入大肠杆菌融合表达载体pET-30a（＋），构建成重组表达质粒pET—TetC，并在大肠杆菌Rosetta（DE3）中表达，经SDS—PAGE蛋白电泳鉴定，表达产物约为50000的重组蛋白，其表达量占菌体总蛋白的33．5％，经免疫印迹试验证实该重组蛋白是破伤风毒素C片段抗原。动物试验证明，此重组抗原具有良好的免疫原性，能保护动物免受破伤风毒素的攻击。 相似文献
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本研究对破伤风毒素C片段进行了基因克隆、重组表达、蛋白纯化和免疫原性分析。应用PCR技术直接从破伤风梭菌64008菌株基因组中扩增出大小为1356 bp的破伤风毒素C片段(TetC)基因,经DNA序列测定分析,扩增出的基因与GenBank上登录的序列AF154828的同源性达到99.2%。将此基因克隆至大肠杆菌融合表达载体pGEX-6P-1,构建成重组表达质粒pGEX-6P-1-TetC,并在大肠杆菌BL21中表达,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的21%。经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定,表达产物为76 Ku左右的重组蛋白,经免疫印迹试验证实该重组蛋白是破伤风毒素C片段抗原。 相似文献
3.
利用DNAStar Protean功能筛选AP1和AP2主要抗原结构域,引入15位柔性多肽,通过重叠延伸PCR技术串联融合AP1、AP2主要抗原域基因,PCR扩增串联体基因片段,将其克隆至pET-30a(+)载体,转化BL21(DM3)细胞,进行高效表达,目的蛋白经亲和层析纯化后进行Western blot鉴定。PCR扩增出320bp的AP1和759bp的AP2主要抗原域,经重叠延伸PCR获得了1 065bp的AP1、AP2串联体基因片段,DNA测序结果表明,无碱基的缺失、突变和移码。构建的重组表达载体经诱导能够可溶性表达,目的蛋白相对分子质量大小约46 000,纯化后重组蛋白的纯度96%,Western blot分析重组融合蛋白结果表明,能够被兔源抗无乳链球菌阳性血清所识别。重叠延伸PCR获得了AP1、AP2主要抗原域串联体,构建了pET-30a(+)/AP1+AP2重组表达载体,诱导目的蛋白呈可溶性表达,表达产物具有良好的免疫反应原性,为进一步研究基于AP1、AP2蛋白的致病机制,检测制剂及疫苗奠定了试验基础。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2017,(3)
为了筛选并鉴定斯氏艾美耳球虫Rhomboid基因抗原优势区,试验采用预测斯氏艾美耳球虫Rhomboid基因跨膜结构域,PCR扩增4段目的片段,构建表达载体,并通过SDS-PAGE和Westernblot技术分析目的蛋白。结果表明:成功克隆出4段斯氏艾美耳球虫Rhomboid基因,片段大小分别为102 bp、75 bp、93 bp、99 bp,重组原核表达质粒p ET-32a-Rho1~4构建成功;经SDS-PAGE和Western-blot分析,构建的4段重组质粒都得到了表达且与理论值相符,且重组蛋白中p ET-32aRho4可与兔斯氏艾美耳球虫阳性血清发生特异性反应。 相似文献
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本试验通过自行设计两段引物,利用重叠延伸PCR方法,将伪狂犬病病毒(PRV)gB基因两段优势抗原表位序列串联,克隆至pMD18-T载体,测序正确后双酶切连接至pET-32a(+)载体,构建重组质粒;重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)受体菌,经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE和Western blotting检测融合蛋白表达情况。经检测,诱导后的重组蛋白获得表达,重组蛋白大小约为54ku,其中串联蛋白大小约为34ku。该重组蛋白可与伪狂犬病病毒gB蛋白单克隆抗体发生特异性反应,表明重组蛋白的抗原性良好。 相似文献
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为表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白主要抗原表位基因序列,参照GenBank中发表的PRRSV SCQ株M蛋白基因设计并合成一对特异性引物,通过PCR方法从重组质粒pMD18-T-M扩增得到缺失N端跨膜区的M蛋白基因片段dM(deleting M),将其与pMD19-T simple vector连接,经测序正确后克隆至高效原核表达载体pGEX-4T-1,得到重组表达载体pGEX-4T-1-dM,并将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG于37℃诱导,PRRSV M基因获得表达。经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白分子量约为35 kDa。以纯化的重组蛋白作为抗原,经Western Blot分析结果表明该重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别,可用于PRRSV的检测。 相似文献
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为表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）M蛋白主要抗原表位基因序列,参照GenBank中发表的PRRSVSCQ株M蛋白基因设计并合成一对特异性引物,通过PCR方法从重组质粒pMD18-T-M扩增得到缺失N端跨膜区的M蛋白基因片段dM（deletingM）,将其与pMD19-Tsimplevector连接,经测序正确后克隆至高效原核表达载体pGEX-4T-1,得到重组表达载体pGEX-4T-1-dM,并将其转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,经IPTG于37℃诱导,PRRSVM基因获得表达。经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白分子量约为35kDa。以纯化的重组蛋白作为抗原,经WesternBlot分析结果表明该重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别,可用于PRRSV的检测。 相似文献
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【目的】构建不同组成型启动子的乳酸菌表达载体系统,评价不同启动子驱动外源基因表达的活性,筛选出强表达的启动子,为后续研究乳酸菌作为活菌载体表达外源抗原或功能性蛋白提供理论依据。【方法】以大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体pPG为骨架,将表达载体中启动子序列分别替换为组成型强启动子Pldh、PHH和Phce,利用PCR方法扩增报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和氨苄青霉素抗性基因(Ampr),并在下游多克隆位点中分别插入荧光素酶(LUC)、EGFP和Ampr报告基因,构建9种乳酸菌表达质粒,电转入副干酪乳杆菌HLJ-27感受态细胞,筛选获得9株重组乳酸菌。通过实时荧光定量PCR检测报告基因在重组菌中的mRNA转录水平,利用Western blotting和间接ELISA检测蛋白的表达量,并检测表达蛋白的活性,以评估3个启动子的活性强弱。【结果】PCR成功扩增出大小约720 bp的EGFP基因和850 bp的Ampr基因。Western blotting结果显示,在9株重组乳酸菌中,分别成功表达出了58 ku的LUC蛋白、26 ku的EGFP蛋白和28 ku的Ampr蛋白。实时荧光定量PCR和间... 相似文献
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猪瘟病毒E2基因抗原结构域A、B、C、D区在大肠杆菌中的表达 总被引：4，自引：0，他引：4
采用PCR技术扩增出猪瘟病毒E2基因抗原结构域A、B、C、D区并克隆于PGEM-T easy载体上，测序结果表明插入的为猪瘟病毒E2基因抗原结构域，切出目的基因，将目的基因克隆到表达质粒pProEX—HTb中，获得重组质粒经PCR、酶切和序列分析鉴定E2基因抗原结构域插入的位置、大小和读码框均正确，SDS—PAGE检测表明受体菌经IPTG诱导后能表达E2基因抗原结构域蛋白，Westernblot检测表明受体菌诱导表达E2基因抗原结构域蛋白可与猪瘟阳性血清发生特异性反应。 相似文献
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从组织病料中提取CAV核酸,根据GenBank上发表的序列设计两对引物,分别扩增出vp1的139 bp～83 bp和547 bp～1337 bp两个基因片段,然后分别将其充隆到原核表达载体PMXB10上,经PCR和酶切鉴定,证明成功构建了重组表达载体PMXB10-vp1C和PMXB10-vp1D。在0.3 mM的IPTG诱导下,融合蛋白在大肠杆菌ER（2566）以分泌型得到大量表达,经大量表达后,用几丁质柱挂柱切割纯化后,得到切割蛋白E、F,在Western blot免疫分析印迹中,两组融合蛋白和切割蛋白与CAV阳性血清均能发生特异性反应。用ELISA方法检验,纯化的两组蛋白与CAV阳性血清均能发生特异性反应。用两组蛋白免疫SPF鸡后,用全病毒ELISA试剂盒检测血清呈阳性,表明两组蛋白均可诱发机体产生抗CAV的抗体。 相似文献
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目的将小反刍兽疫病毒M蛋白基因截短表达后用于特异性单抗制备及临床抗体水平检测。方法:用在线分析软件BepiPred分析小反刍兽疫病毒M蛋白潜在的B细胞线性表位,以本实验室构建的pCR2.1T-PPRV M质粒为模板,扩增三段截短的M基因,纯化后的PCR产物分别与克隆载体pCR2.1T连接,筛选出的阳性重组质粒经双酶切后,分别与表达载体pET-32a(+)及pGEX-6p-1连接,再将鉴定为阳性的重组质粒转化入E.coli BL21(DE3)菌株诱导表达,并用SDS-PAGE及Western blot验证。结果 PCR产物电泳,得到与预期大小相符的特异性片段。对连接克隆载体及表达载体的重组质粒双酶切后,均出现与预期一致的片段,DNA测序表明,插入片段序列与小反刍兽疫Nigeria75/1株M蛋白基因完全一致。重组蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定,证明所构建的重组蛋白均获得高效表达,并均具有良好的反应原性。结论成功表达了小反刍兽疫截短M基因的蛋白,为制备特异性单抗及小反刍兽疫抗体检测奠定了一定基础。 相似文献
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为原核表达汉坦病毒(HV)L蛋白,本研究根据HV 76-118株全长L基因序列分段设计合成了6对引物.通过RT-PCR方法分段扩增L基因的6个片段,分别克隆于原核表达载体pET-30a中,并转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中进行表达.SDS-PAGE分析表明,获得与预期分子量一致的特异的目的蛋白.Western blot检测表明,重组蛋白与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性反应. 相似文献
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This study was amied to construct and identify the prokaryotic expression plasmids of outer membrance protein H (OmpH) of Coxiella burnetii and analysis its immunogenicity. Amplified OmpH gene from the Nine Miles by PCR, the results showed that the OmpH included 798 bp. Cloned OmpH gene into prokaryotic expression vector pQE-30 after identified by PCR,enzyme digestion and sequence. Constructed the recombinant plasmid pQE-30/OmpH,and then the plasmid was transformed into BL21(DE3) competent cells and induced by IPTG. The results showed that pQE-30/OmpH recombinant proteins were 25 ku by SDS-PAGE, and Western blotting assay indicated that the recombinant protein could express OmpH protein with significant antigencity. 相似文献
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犬细小病毒VP2截短基因的原核表达及表达蛋白抗原性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
采用PCR方法扩增了犬细小病毒（Canineparvovirus,CPV）2段VP2截短基因,将2段短基因片段分别克隆至原核表达载体pET-32a（＋）中,表达质粒命名为pET-32a-306和pET-32a-363。将pET-32a-306和pET-32a一363转化至宿主菌E．coliBL21（DE3）,IPTG诱导后进行SD孓PAGE和Westernblotting分析。结果显示,融合蛋白相对分子质量大小为30000和33000;与全长VP2蛋白相比,目的蛋白得到了高效表达,且都为可溶性表达。West—ernblotting结果表明,该蛋白融合表达并且有很好的免疫反应原性,可为CPV亚单位疫苗和免疫学诊断方法的研究提供候选抗原。 相似文献
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根据伪狂犬病病毒 Rise毒株 g E基因序列 ,设计合成 1对引物 ,采用 PCR方法 ,从伪狂犬病病毒闽 A株 DNA扩增出 5 5 8bp片段。将该片段克隆到 p UC19质粒中 ,测序正确后再将其克隆到表达质粒 p ET- 2 8a中 ,以 BL 2 1(DE3)为宿主菌 ,在 IPTG诱导下获得了高效表达。经 SDS- PAGE及 Western- blotting鉴定分析 ,表达蛋白大小约 2 30 0 0 ,蛋白薄层扫描分析表明 ,该蛋白约占菌体总蛋白的 30 %。 相似文献
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水牛抑制素α亚基基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR方法从水牛卵巢总RNA中扩增抑制素α亚基基因,并克隆入pMD18-T载体,进行PCR、双酶切及测序鉴定.序列分析结果表明:水牛抑制素α亚基基因编码序列长为1 083 bp,编码360个氨基酸,与牛、人、猪抑制素α亚基基因CDS成熟蛋白氨基酸的同源性分别为96%、80%、87%,表明抑制素α亚基是一组在进化上高度保守的蛋白质.将水牛抑制素α亚基基因CDS克隆到pET-30a表达载体中,转化宿主菌BL21(DE3)进行原核表达.在1 mmol/L IPTG 中,37 ℃诱导表达4 h后抑制素α亚基基因重组蛋白可成功获得表达.将表达产物进行SDS-PAGE分析,结果表达产物主要以包涵体形式存在,分子质量约为40 ku. 相似文献
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猪生长激素基因在昆虫细胞中的分泌表达 总被引：9，自引：0，他引：9
将PCR将增得到pGH基因插入到带有polh启动子和gp67强信号肽序列的杆状病毒转移载体pAcGP67-A中，构建重组质粒pGP67pGH，并与线性化致死缺失型苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（AcMNPV-OCC)基因组DNA共转染Sf9细胞，构建出重组病毒AcMNPV-pGP67-pGH-OC^-。感染重组病毒的Hi5细胞的表达产物的SDS-PAGE和Western blot结果表明，细胞可溶蛋白和培养液上清中均有一条分子量约为22kDa的猪生长激素特异性反应带，且培养液上清中的目的蛋白分子量比天然pGH略大一些，薄层扫描仪扫描估测可知，重组pGH分别占细胞可溶蛋白的8．98％和培养液上清总蛋白的3.61%。将表达96h的培养液上清浓缩液进行N－糖基化分析，结果显示重组pGH无N－糖基化加工修饰。 相似文献
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