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1.
《黑龙江畜牧兽医》2015,(9)
为了探究鸭肠炎病毒(DEV)TK基因编码蛋白在相关细胞上作用与功能及其在病毒感染周期、机体免疫应答中的作用,试验以DEV C-KCE株基因组DNA为模板扩增获得TK基因,在p ET-32a(+)/Rosetta(DE3)p Lys系统中原核表达,并用IPTG诱导DEV TK重组蛋白。结果表明:经SDS-PAGE分析,外源基因主要以包涵体形式表达,分子质量约为59 ku;经Ni-NTA纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,抗体效价可达到1∶4;经Western-blot分析,制备的多克隆抗体可特异性识别重组蛋白;间接免疫荧光试验证实,制备的多克隆抗体与DEV的TK基因编码产物反应性良好。说明TK基因表达蛋白在鸭肠炎感染周期及机体的免疫应答中发挥着至关重要的作用。 相似文献
2.
以鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株基因组DNA为模板,PCR扩增获得SORF3(S3)基因,在pET-32a(+)/Rosetta(DE3)pLys系统中原核表达。S3重组蛋白经IPTG诱导,SDS-PAGE分析显示外源基因以包涵体形式表达为主,分子质量约为52ku。重组蛋白经Ni-NTA纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,琼脂扩散法测得抗体效价为1:4。经Western blotting分析制备的多克隆抗体具有较高的特异性,间接免疫荧光试验证实制备的多克隆抗体与DEV的SORF3编码产物反应性良好,为进一步研究DEVSORF3结构与功能特性奠定了基础。 相似文献
3.
本研究旨在克隆、表达鸭干扰素刺激基因（interferon-induced proteins with tetratricopeptide repeats 5,IFIT5）并制备其多克隆抗体。根据GenBank公布的绿头鸭IFIT5（登录号：KF956064）序列设计特异性引物,PCR扩增获得鸭IFIT5基因,并构建原核表达重组质粒pET-30a-IFIT5和pET-32a-IFIT5及真核表达重组质粒pcDNA3.1-IFIT5。原核表达获得鸭IFIT5重组蛋白后,进行SDS-PAGE分析,并利用镍柱亲和层析方法对重组蛋白进行纯化。以纯化的鸭IFIT5重组蛋白为免疫原制备兔抗鸭IFIT5多克隆抗体。利用间接ELISA测定多克隆抗体效价、用Western blotting鉴定其特异性;将真核表达重组质粒pcDNA3.1-IFIT5转化BHK21细胞,通过间接免疫荧光法鉴定多克隆抗体的反应性。结果表明：目的蛋白主要以包涵体的形式存在;制备的兔抗鸭IFIT5多克隆抗体效价达1：49 600,可特异性识别鸭IFIT5重组蛋白,间接免疫荧光试验则表明纯化的多克隆抗体可特异性识别BHK21瞬时真核表达的鸭IFIT5蛋白。综上,成功克隆了鸭干扰素刺激基因IFIT5,制备的兔抗鸭IFIT5多克隆抗体可用于鸭IFIT5蛋白的检测,可为鸭IFIT5蛋白的后续研究提供材料支撑。 相似文献
4.
参照已发表的鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus,DEV）基因组序列,利用生物学软件DNAstar进行序列分析,设计并合成一对特异性引物,PCR扩增了长855 bp的gB基因片段.将目的片段克隆至pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,定向克隆至pET30a表达载体中,经PCR、酶切鉴定正确后,重组质粒转化BL21表达茵,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白.重组蛋白在变性的条件下采用Ni柱亲和层析法纯化,变性蛋白复性后,Western blot检测表明重组蛋白具有良好的反应活性,以该蛋白作为诊断抗原,初步建立了检测鸭肠炎病毒抗体的间接ELISA诊断方法,为鸭肠炎病毒抗体诊断试剂盒的研制奠定了基础. 相似文献
5.
《山东畜牧兽医》2019,(12)
为制备识别K亚群禽白血病病毒(ALV-K)兔源多克隆抗体,将含ALV-Kgp85基因的表达质粒在大肠杆菌体内进行诱导表达,获得含his标签的大小为55KD的重组蛋白;将纯化后的表达蛋白免疫接种5只青年兔,三次加强免疫后检测收获血清抗体,ELISA检测血清抗体效价;对血清抗体进行纯化并检测抗体亚型,Western-blot和IFA检测抗体对ALV-Kgp85蛋白和病毒识别特性。结果表明,获得的抗体效价达到8×10~7,抗体亚型为IgG2b,该抗体能够特异性识别ALV-Kgp85蛋白和DF1细胞中的ALVK病毒,可以用于IFA临床检测,为K亚群禽白血病的快速检测奠定了基础。 相似文献
6.
《上海畜牧兽医通讯》2016,(3)
根据GenBank中已经发表的猪巨细胞病毒gB基因序列,选择抗原富集区设计引物,将目的片段克隆后与原核表达载体pGEX-6p-1连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导获得重组蛋白,将其纯化后免疫新西兰兔。用间接ELISA测定血清抗体效价,并采用Western blot验证特异性。结果表明:PCR扩增产物的大小与预期结果相符;重组蛋白大小为预期的48ku,主要以包涵体形式存在,纯化获得了可溶性重组蛋白;免疫兔子血清的ELISA抗体效价为1∶256 000,能检测到预期的48ku蛋白条带,获得的重组抗原和免疫血清可应用于猪巨细胞病毒的临床检测。 相似文献
7.
差速离心和蔗糖密度梯度离心纯化鸭病毒性肠炎病毒(DEV)免疫兔制备兔抗DEV高免血清后,用DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化的兔抗DEVIgG建立了间接免疫荧光染色法(IFA)检测石蜡切片中DEV的方法。IFA的最佳条件为:石蜡切片用10mmol/L pH6.0的柠檬酸缓冲液为微波修复液微波修复10min,胰酶修复20min;10%小牛血清室温封闭30min;加入1∶25的兔抗DEVIgG于4℃孵育过夜;再加入FITC标记的羊抗兔IgG于37℃孵育45min。以建立的IFA对DEV人工皮下感染死亡鸭的各组织器官进行检测,在死亡鸭的脾脏、胸腺、法氏囊、肝脏、食道、十二指肠、直肠及肺脏中检测到DEV抗原。研究表明,IFA检测石蜡切片中的DEV具有直观、特异性强的优点,是对DEV进行检测和抗原定位的良好方法。 相似文献
8.
牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的多克隆抗体制备及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白的兔源多克隆抗体,本研究利用表达BVDV E2蛋白的重组质粒pET30a-E2转化E.coli BL21(DE3),经诱导表达获得重组E2蛋白。Western blot检测显示纯化蛋白能够与BVDV参考阳性血清反应。以纯化的重组E2蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,病毒中和试验测定其中和效价为1:2048,间接免疫荧光和western blot试验表明其具有良好的反应性和特异性。本研究制备的BVDV重组E2蛋白兔源多克隆抗体可应用于BVDV的检测,同时为进一步建立检测BVDV E2蛋白的ELISA方法奠定基础。 相似文献
9.
A型塞内卡病毒VP2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备 总被引：1，自引：1，他引：0
本研究旨在表达A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)的衣壳蛋白VP2,并制备其多克隆抗体。以SVA GD01/2017分离株RNA为模板,RT-PCR扩增VP2基因序列,并克隆至原核表达载体pET-30a(+)中构建重组质粒pET-30a-SVA-VP2。经测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达。在非变性条件下,利用Ni-NTA琼脂糖树脂从菌体裂解液上清中纯化重组SVA VP2蛋白,并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用Protein A Sepharose CL-4B树脂从兔血清中亲和层析纯化多克隆抗体,并对其进行间接免疫荧光分析。结果显示,重组SVA VP2蛋白以可溶性和包涵体两种形式在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞内进行表达,分子质量约为47ku;制备的兔抗VP2蛋白多克隆抗体效价高达1∶64 000,该多克隆抗体仅识别SVA,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、脑心肌炎病毒、猪瘟病毒和猪伪狂犬病病毒等常见猪病原无交叉反应,表明制备的多克隆抗体具有良好的特异性。重组SVA VP2蛋白及其多克隆抗体的成功制备为猪塞内卡病毒病血清学检测方法的建立提供了良好的生物材料。 相似文献
10.
本研究旨在表达A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)的衣壳蛋白VP2,并制备其多克隆抗体。以SVA GD01/2017分离株RNA为模板,RT-PCR扩增VP2基因序列,并克隆至原核表达载体pET-30a(+)中构建重组质粒pET-30a-SVA-VP2。经测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达。在非变性条件下,利用Ni-NTA琼脂糖树脂从菌体裂解液上清中纯化重组SVA VP2蛋白,并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用Protein A Sepharose CL-4B树脂从兔血清中亲和层析纯化多克隆抗体,并对其进行间接免疫荧光分析。结果显示,重组SVA VP2蛋白以可溶性和包涵体两种形式在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞内进行表达,分子质量约为47ku;制备的兔抗VP2蛋白多克隆抗体效价高达1∶64 000,该多克隆抗体仅识别SVA,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、脑心肌炎病毒、猪瘟病毒和猪伪狂犬病病毒等常见猪病原无交叉反应,表明制备的多克隆抗体具有良好的特异性。重组SVA VP2蛋白及其多克隆抗体的成功制备为猪塞内卡病毒病血清学检测方法的建立提供了良好的生物材料。 相似文献
11.
为探究表达鸭肠炎病毒(DEV)gB/NP28双基因重组减毒沙门菌口服疫苗在鸭体内诱导免疫应答能力,本研究将构建的重组菌(pcDNA3.1-DEV-gB/NP28)/SL7207、DVE弱毒疫苗、重组质粒pcDNA3.1-DEV-gB/NP28及PBS分别免疫雏鸭,通过间接免疫荧光法检测免疫鸭脾脏、胸腺、法氏囊、哈德氏腺组织中的抗原表达;双抗体夹心ELISA方法检测肠道黏膜sIgA;间接ELISA方法监测血清中DEV特异性抗体、外周血T淋巴细胞增殖及IFN-γ、IL-4细胞因子含量,对该口服疫苗进行免疫学评价。结果表明,重组菌能够诱导鸭产生良好的黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫应答;攻毒试验显示,在DVE强毒攻击下重组菌免疫可提供75%以上的保护,表明重组菌免疫对DEV攻击具有一定的免疫保护作用。 相似文献
12.
研究旨在表达流行性出血病病毒（EHDV） VP7蛋白并制备其多克隆抗体，为EHDV检测方法的建立提供材料。试验通过大肠杆菌进行VP7重组蛋白的诱导表达，通过镍离子亲和层析与透析进行重组蛋白的纯化与复性并免疫家兔制备多克隆抗体，通过间接ELISA、Western blotting与间接免疫荧光试验（IFA）分析多克隆抗体的效价与反应原性。结果显示，在37℃与IPTG （0.1 mmol/L）的诱导下，VP7重组蛋白（分子质量46 ku）以包涵体形式高效表达，纯化与复性处理后的重组蛋白纯度达94.52%，可与不同血清型的EHDV阳性血清特异性结合。制备的兔抗VP7蛋白多克隆抗体效价达1∶24 000；以制备的多克隆抗体为一抗，通过IFA与Western blotting检测到EHDV感染细胞中VP7蛋白的表达。本研究在大肠杆菌中实现了EHDV VP7蛋白的高效表达，制备的兔抗VP7蛋白多克隆抗体具有良好的反应原性与特异性，为EHDV诊断抗原的制备与血清学检测方法的建立提供了试验材料。 相似文献
13.
以本实验室获得的鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株US区基因序列(GenBank登录号EU714267)为基础PCR扩增出gD基因胞外区(gDw),将其定向克隆至原核表达载体pET-30a(+)并转化至大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLys。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表明gD基因胞外区在大肠杆菌中获得与预期大小相符的表达蛋白。重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,血清琼扩效价达1∶16,噬斑减数中和试验测定血清中和抗体效价达1∶64。通过免疫荧光技术首次对gD进行亚细胞定位检测,结果表明DEV感染鸭胚成纤维细胞(DEF)后4h近核区域细胞质内首先开始出现荧光,12h以后显著增加,明显的点状绿色荧光广泛存在于胞质中。本研究为进一步开展DEV gD的功能研究提供了重要数据和材料。 相似文献
14.
为制备抗双峰驼IgA的抗体,将双峰驼IgA重链恒定区基因克隆至pET-28a(+)上,构建重组蛋白质粒pET-28a-IgA-H,再进行IPTG诱导表达、分析和纯化,以及SDS-PAGE和Western blot验证。用以获得的目的蛋白制备兔抗双峰驼IgA多克隆抗体,并通过ELISA和Western blot检测效价及其特异性。结果表明,获得的重组目的蛋白大小约为39ku,最佳诱导表达条件为IPTG 23.83μg/mL、诱导时间6 h,且重组蛋白主要以包涵体的形式表达。ELISA检测显示抗体效价达1∶32 000,Western blot鉴定抗体能特异性识别原核表达的pET-28a-IgA-H蛋白,并能有效地将双峰驼IgA与IgG区别开来,表明成功获得了双峰驼IgA重链恒定区的重组蛋白及特异性良好的多克隆抗体。 相似文献
15.
本研究旨在表达口蹄疫病毒(FMDV)的VP1全基因并制备特异性的多克隆抗体。利用PCR方法扩增Asia 1 IND 49197株VP1全基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,在大肠杆菌BL21中进行表达。SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为31.6ku,以包涵体的形式存在。通过Ni-NTA Purification System纯化后进行western blot和间接ELISA分析,结果显示重组蛋白能够被FMD阳性血清识别,具有良好的反应性。将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,ELISA测定抗体效价为1∶20480,病毒中和试验测定抗体效价为1∶64。本研究所表达的VP1蛋白可用于开发检测Asia1口蹄疫抗体的诊断试剂,所制备的多克隆抗体为进一步研究VP1的结构、功能以及抗原表位的鉴定提供了条件。 相似文献
16.
17.
为表达H6N6亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）神经氨酸酶（NA）蛋白,并制备多克隆抗体,本试验根据GenBank中AIV N6基因序列（登录号：MG434500）设计特异性引物,对贵州地区分离的H6N6亚型AIV贵州株进行N6基因PCR扩增,将其克隆到原核表达载体pET-32a （+）中,构建重组原核表达载体pET-32a-N6,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达His-N6重组蛋白,将诱导产物超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化,并利用SDS-PAGE和Western blotting对表达蛋白进行双重鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价。结果显示,AIV贵州株N6基因编码区长1 380 bp,可编码459个氨基酸,其中175－207 bp缺失33个核苷酸;重组质粒pET-32a-N6经双酶切鉴定分别获得大小为5 900 bp左右的载体条带和1 380 bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-32a-N6重组质粒;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,重组蛋白主要存在于沉淀中,以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为70 ku,与预期结果一致;纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在70 ku处出现条带,说明纯化的蛋白为重组蛋白pET-32a-N6,表达产物具有免疫学活性,包涵体经变性、复性处理,重组表达蛋白分别被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。间接ELISA检测其效价高于1∶3 200。以上结果表明,试验成功克隆、表达了H6N6亚型AIV的N6基因,所制备的N6蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性,能被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。 相似文献
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本研究旨在利用原核表达系统表达新型鸭呼肠孤病毒（NDRV） DH13株重组σB蛋白,并检测其免疫原性,为NDRV基因工程疫苗研制等提供物质材料。采用RT-PCR方法扩增获得NDRV σB基因,构建原核表达重组质粒pET-30a-σB和pET-32a-σB,将2个重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,利用IPTG诱导获得相应的重组蛋白,通过SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式。纯化无His的σB蛋白,并以此蛋白作为免疫原免疫新西兰白兔,制备兔源多克隆抗体。利用Ni2+柱亲和层析法纯化含His的σB蛋白,以此蛋白作为检测原,通过间接ELISA方法测定兔源多克隆抗体效价;Western blotting鉴定多克隆抗体与重组蛋白的特异性识别能力。结果显示,PCR扩增获得大小约为1 100 bp的σB基因片段。SDS-PAGE结果显示,高效表达出了2种重组σB蛋白,大小分别约为41和46 ku,均以包涵体形式存在。间接ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价达1∶204 800,能特异性地识别原核表达的重组蛋白,表明重组无His的σB蛋白具有良好的免疫原性。Western blotting特异性鉴定结果显示,含His的σB蛋白和无His的σB蛋白均与制备的兔源多克隆抗体发生特异性反应,表明原核表达得到的重组σB蛋白具备良好的反应原性。本试验利用原核表达系统成功地表达出了重组σB蛋白,并证实了重组NDRV σB蛋白具有良好的免疫原性及反应原性,该结果将有助于后续对NDRV σB蛋白生物学功能的鉴定、NDRV诊断用抗原的制备及NDRV新型疫苗的研制。 相似文献
19.
《中国畜牧兽医》2018,(11)
为表达H6N6亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)神经氨酸酶(NA)蛋白,并制备多克隆抗体,本试验根据GenBank中AIV N6基因序列(登录号:MG434500)设计特异性引物,对贵州地区分离的H6N6亚型AIV贵州株进行N6基因PCR扩增,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组原核表达载体pET-32a-N6,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达His-N6重组蛋白,将诱导产物超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化,并利用SDS-PAGE和Western blotting对表达蛋白进行双重鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价。结果显示,AIV贵州株N6基因编码区长1 380bp,可编码459个氨基酸,其中175-207bp缺失33个核苷酸;重组质粒pET-32a-N6经双酶切鉴定分别获得大小为5 900bp左右的载体条带和1 380bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-32a-N6重组质粒;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,重组蛋白主要存在于沉淀中,以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为70ku,与预期结果一致;纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在70ku处出现条带,说明纯化的蛋白为重组蛋白pET-32a-N6,表达产物具有免疫学活性,包涵体经变性、复性处理,重组表达蛋白分别被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。间接ELISA检测其效价高于1∶3 200。以上结果表明,试验成功克隆、表达了H6N6亚型AIV的N6基因,所制备的N6蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性,能被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。 相似文献
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本试验旨在克隆表达羊口疮病毒(ORFV)蛋白ORFV086,制备兔抗ORFV086蛋白多克隆抗体并检测ORFV086蛋白的表达。以ORFV基因组DNA为模板,利用PCR方法扩增ORFV086的基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-33b(+)。将构建的pET33b-086重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3) pLys 感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达,以纯化蛋白作为免疫原,免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体。应用ELISA和Western blotting方法对所得抗体进行检测。结果显示,重组蛋白pET33b-086主要以包涵体形式存在,分子质量约为100 ku;目的蛋白经切胶纯化回收后作为免疫原制备的多克隆抗体效价达1:128000;纯化的多克隆抗体可用于检测重组及天然ORFV086蛋白,特异性好。本试验制备了ORFV086多克隆抗体,为深入研究ORFV086蛋白在羊口疮病毒感染过程中的作用奠定了基础。 相似文献