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鲤鱼白细胞介素-8全长cDNA的克隆、鉴定及其差异表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
用DD-RTPCR的方法获得差异显示片段A26,经地高辛标记作为探针对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库核酸杂交筛选,从0.8×104个重组噬菌体中,经过2轮筛选获得阳性克隆。序列分析表明该克隆含有1个大小为294bp编码98个氨基酸的完整开放阅读框,氨基酸序列含有Chemokine-CXC功能结构域,前体中含有22个氨基酸组成的引导肽,氨基酸序列比对显示成熟白细胞介素-8(IL-8)多肽中第12、13和14构成CXC基序,但之前无ELR基序。系统发生分析其与荷兰鲤鱼亲缘关系最近,氨基酸序列的同源性达89%。分离培养鲤鱼外周血白细胞,在不同条件下经LPS、PHA和ConA刺激后,提取总RNA,根据鲤鱼IL-8全长cDNA序列和β-ac-tin序列设计引物,利用半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法对鲤鱼外周血白细胞IL-8进行差异表达分析,结果显示,经有丝分裂原刺激后前期(4h)白细胞中IL-8的表达量明显增大,但随着时间推移(12、24h)并不一直比同期正常白细胞表达量大,表达量趋势成峰形图。 相似文献
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本试验以鲤鱼外周血白细胞肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)EST序列为基础,经地高辛标记后作为探针,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,从重组噬菌体中经过两轮筛选获得阳性克隆。序列分析结果显示,该序列包含有5'-非编码区(5'-UTR) 25 bp;3'-非编码区(3'-UTR) 535 bp,存在2个mRNA不稳定基序ATTTA;开放阅读框ORF长1632 bp,编码543个氨基酸。预测蛋白质等电点为5.88,分子质量大小为61.773 ku。序列同源性比对结果表明,所获得的序列与GenBank上登录的鲤鱼TRAF6a基因同源性达99%。蛋白质序列分析结果发现,其具有TRAF家族的典型序列特征。 相似文献
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试验旨在获得鲤鱼诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)cDNA全长序列,并以此为基础探讨在丝裂原刺激下外周血白细胞中iNOS的表达变化。以从鲤鱼正常外周血白细胞cDNA文库中获得的iNOS的EST序列为基础,采用基因文库筛选和cDNA5'末端快速扩增技术(5'-RACE)相结合的方法,成功扩增出鲤鱼iNOScDNA全长序列,然后进行鲤鱼外周血白细胞原代培养,分成对照组和试验组,其中试验组分别为脂多糖(LPS,1.0μg/mL)刺激4、12h,刀豆蛋白A(ConA,1.0μg/mL)刺激4、24h,对照组为相同培养时间无丝裂原刺激的外周血白细胞,根据得到的iNOScDNA全长序列和鲤鱼β-actin序列分别设计特异性引物,应用实时荧光定量PCR方法检测各组外周血白细胞中iNOS在mRNA水平上的表达情况并进行分析。序列分析结果显示,最后获得的cDNA片段共3704bp,包含74bp的5'端非编码区,246bp的3'端非编码区,一个3384bp的完整的开放阅读框(ORF),共编码1127个氨基酸。序列同源性分析结果显示,该序列与鲫鱼iNOS基因同源性高达100%;实时荧光定量PCR结果显示,经LPS、ConA刺激的试验组外周血白细胞中iNOS表达量均升高,且短时间(4h)刺激的表达量高于长时间(LPS12h;ConA24h)刺激的表达量。综上所述,在LPS、ConA刺激过程中,iNOS在外周血白细胞中表达量均有上调,结果提示存在炎症反应的动态变化。 相似文献
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试验以鲤鱼外周血白细胞肿瘤坏死因子α1(tumor necrosis factor alpha 1,TNFα1) EST序列为基础,经地高辛标记作为探针对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,从0.9×104个重组噬菌体中,经过2轮筛选获得3个阳性克隆。序列分析结果显示,该序列包含128 bp的5''非编码区(5''-UTR),423 bp的3''非编码区(3''-UTR),开放阅读框ORF长768 bp,共编码255个氨基酸,在其3''非编码区存在几个ATTTA不稳定基序。预测蛋白等电点为8.20,分子质量大小为28.1 ku。序列同源性比较结果表明,所获序列与GenBank上登录的鲤鱼TNFα基因的同源性达94%。蛋白质的序列和结构分析结果发现,其具有TNF家族的典型序列特征、1个跨膜区结构和1个假定的产生成熟肽的裂解位点。 相似文献
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通过对鸽脑垂体cDNA文库进行筛选,获得过氧化物还原酶(Peroxiredoxins,Prx)基因的全长cDNA序列,Prx 基因编码区781 bp编码254个aa,该序列的GenBank登录号为JQ364950.聚类结果表明:鸽子、鸡、斑胸草雀首先聚在一起,与啮齿类动物、草食动物、灵长类动物的遗传距离逐渐增大.本研究对鸽Prx基因的全长cDNA序列克隆和分析,为深入探讨Prx对蛋白酶体诱导细胞分化凋亡的作用机制提供理论和试验参考. 相似文献
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本研究旨在从长白猪肝脏组织中克隆与脂质存储相关的CIDEB基因编码区全长序列,并进行生物信息学分析,为研究其结构和功能奠定基础。根据NCBI中的猪CIDEB基因mRNA序列(登录号:NM001112688.1)设计特异性引物,采集长白猪新鲜的肝脏组织,提取RNA并反转录合成cDNA,以cDNA为模板进行PCR扩增,将PCR产物与pcDNA3.1+载体连接,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆后进行生物信息学分析。结果显示:长白猪CIDEB基因编码区序列全长为660 bp,编码了219个氨基酸,与人同源性最高,为92.2%。对长白猪CIDEB蛋白进行生物信息学分析表明,CIDEB蛋白属于亲水性蛋白,不存在跨膜结构,属于CIDE-N家族成员之一,不同物种的CIDEB蛋白具有很高的保守性,其二级结构α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占44.29%、18.26%、8.22%、29.22%。本实验成功构建了CIDEB基因的全长真核表达载体,并对其核苷酸、氨基酸进行序列分析,为进一步研究和揭示长白猪CIDEB蛋白的结构与功能提供了基础材料。 相似文献
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荣昌猪白细胞介素-2和白细胞介素-4基因的克隆与序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
将荣昌猪外周血淋巴细胞在刀豆素A(ConA)的刺激下培养24~70 h后,提取总RNA,应用RT-PCR技术扩增白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-4(IL-4)cDNA,克隆到pMD18-T载体并测序。结果表明:克隆的IL-2 cDNA全长为522个碱基,ORF为465个碱基,编码154个氨基酸,与GenBank公布的猪IL-2比对同源性均为99.8%;克隆的IL-4 cDNA全长411个碱基,ORF为402个碱基,编码133个氨基酸,与GenBank公布的猪IL-4比对同源性均在98.0%以上,从而证实成功克隆了荣昌猪IL-2和IL-4基因cDNA。 相似文献
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马白细胞介素18成熟蛋白(mEIL-18)基因在大肠埃希氏菌中的高效表达与纯化 总被引：2，自引：0，他引：2
用RT—PCR从经ConA刺激的马外周血单个核细胞（PBMC）中扩增出马白细胞介素18（Equine interleukin-18，EIL-18）前体蛋白（precursor EIL-18，pEIL-18）基因的cDNA，然后克隆至载体pCR2．1-TOPO中，鉴定并命名为pCR2．1-pEIL-18。自pCR2．1-pEIL-18中扩增马白细胞介素18成熟蛋白（mature EIL-18，mEIL-18）基因，并将其亚克隆至原核表达载体pET-28a（＋）中。将筛选出的阳性克隆进行测序、诱导表达并纯化其表达产物。结果表明，mEIL-18基因全长474bp，含1个开放阅读框，编码157个氨基酸的成熟蛋白；表达产物以可溶性和包涵体两种形式存在，经SDS-PAGE和Western—blot分析，重组蛋白相对分子量约为20ku，且具有免疫生物学活性。mEIL-18基因在大肠杆菌中高效表达并在非变性和变性条件下采用Ni^＋亲和层析纯化方法获得了高纯度的重组mEIL-18，为探究马白细胞介素18的生物学活性及其应用奠定了基础。 相似文献
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旨在克隆猪作用于RNA的腺苷脱氨酶2基因（ADAR2）全长cDNA序列,同时对该基因在猪不同组织中的表达规律进行探索。利用RACE （rapid-amplification of cDNA ends）对大白猪ADAR2基因mRNA全长序列进行克隆,并进行生物信息学分析;用荧光定量PCR方法检测35日龄大白猪心、肝、肺、肾、脾、脑、小肠、背最长肌和背部脂肪9种组织中ADAR2的表达水平。结果表明,猪ADAR2基因cDNA全长6 305 bp,共包含12个外显子,编码704个氨基酸,与人、黑猩猩、猕猴、长臂猿、黄牛、山羊和绵羊的CDS区核酸序列和氨基酸序列的一致性均在84%以上。该基因编码的蛋白含有2个双链RNA结合基序和一个脱氨酶结构域。猪ADAR2在检测的各组织中均表达,其中在肺中的表达量最高。综上所述,本研究成功克隆了猪ADAR2基因全长cDNA序列,并且发现其在猪体内广泛表达,为深入研究ADAR2的功能奠定了良好的基础。 相似文献
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CD154在抗原特异的T淋巴细胞和抗原提呈细胞的相互作用中发挥非常重要的作用。利用RT-PCR方法从三黄鸡的外周血单核细胞(PBMC)中克隆了鸡CD154基因全长cDNA,序列分析显示该基因cDNA全长819bp,可编码272个氨基酸。将克隆的鸡CD154全长cDNA克隆到原核表达载体pET-28a中获得表达质粒pET-28a-CD154,转化BL21(DE3)后未检测到特异性表达蛋白。进一步通过PCR获得去除信号肽(1~22 aa)和跨膜区(23~46 aa)的CD154基因片段(CD154d),并将其克隆到pQE80的6×His下游,在大肠杆菌中成功表达,获得分子量约27 ku的融合表达蛋白6×His-CD154d。Western-blot试验证实表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应。同时,将CD154基因全长cDNA插入真核表达载体pEGFP-C1的EGFP基因下游,获得真核表达质粒pEGFP-CD154,转染Hela细胞,荧光显微镜观察发现EGFP-CD154融合蛋白表达在细胞膜上,证实了鸡CD154的膜定位特性。本研究为进一步研究鸡CD154的结构与功能及其免疫佐剂效应奠定了基础。 相似文献
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魏静 《四川畜牧兽医学院学报》2009,(4):28-32
在现代法律秩序中,商会自治规范是制定法的基础和必要的补充,甚至在某些方面替代了制定法;商会自治规范主要包括商会组织规范、行为规范、惩罚规范以及争端解决规范等;其效力仅及于其内部成员;商会自治规范和制定法之间存在冲突,但也存在整合的基础。 相似文献
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以国际标准强毒Ｒ株人工感染非免疫产蛋鸡,定时扑杀,分别从鼻窦、眶下孔、气管、肺、气囊、卵巢和输卵管分离ＭＧ,并收集感染鸡所产蛋分离ＭＧ。结果表明,人工感染４８小时后上、下呼吸道及肺已被全面感染,９６小时气囊已被感染,１２０小时输卵管已能分离到ＭＧ,卵巢始终分离不到ＭＧ。人工感染鸡自１４４小时便能在其所产蛋中分离出ＭＧ。药物治疗能在７２小时内消除感染,油乳剂苗则需２４天后逐渐降低蛋内ＭＧ分离率,药物卵内注射、种蛋药浴、高温处理均能杀死卵内ＭＧ,但以研制的种蛋浸泡剂药浴效果为最好。 相似文献
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本文概述了猪的毛色类型、猪的毛色遗传模式,着重综述了猪毛色基因分子基础的研究进展,指出存在问题并就未来发展方向做了思考。 相似文献
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REASONS FOR PERFORMING STUDY: Centesis of the bicipital bursa using an 8.9 cm long spinal needle has been reported but the alternative of employing a 3.8 cm long hypodermic needle requires validation. OBJECTIVE: To compare the efficacy of 2 different methods of centesis of the bicipital bursa and to evaluate the usefulness of ultrasonographic imaging to determine the location of solution administered when centesis of the bursa is attempted. METHODS: For Trial 1, 6 clinicians, who had no previous experience of centesis of the bicipital bursa, attempted to inject a solution composed of an aqueous radiopaque contrast medium and physiological saline solution (PSS) into the bicipital bursae of 2/12 horses using the previously described distal approach to inject one bursa and a proximal approach to inject the contralateral bursa. The bicipital tendon and bursa were examined ultrasonographically before and after injection; and both shoulders were examined radiographically to identify the location of the medium. In Trial 2, another 6 clinicians, also with no previous experience of centesis, repeated Trial 1, using 6 horses, but the radiopaque contrast medium was mixed with air instead of PSS. RESULTS: Accuracy of centesis using the proximal approach was 39% and that of the distal approach 28%. Ultrasonographic examination of the shoulder allowed the location of solution and air to be accurately predicted in all 12 shoulders examined. CONCLUSIONS: Clinicians who have had no previous experience performing centesis of the bicipital bursa are unlikely to be successful in centesis using either approach. Radiographic examination after injecting a radiopaque contrast medium may be necessary to assess the success of centesis especially if bursal fluid is not obtained during centesis. Injecting air along with the radiopaque contrast medium provides more accurate ultrasonographic confirmation of centesis and better radiographic definition than does injection without air. 相似文献
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