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1.
本研究旨在克隆水牛MBD3基因,进行生物信息学分析,并构建MBD3基因的真核表达载体,为研究MBD3基因在水牛胚胎发育及诱导多能干细胞（iPSCs）中的作用奠定基础。试验从卵巢组织中提取总RNA,反转录得到cDNA,并以此为模板,应用RT-PCR克隆得到MBD3基因,测序并应用相关的生物学软件进行分析;将MBD3基因连接至真核表达载体pEGFP-C1,再将携带目的基因的重组质粒转染HEK293T细胞和水牛胎儿成纤维细胞（BFF）,利用RT-PCR及Western blotting方法分析目的基因的表达。结果表明,克隆获得了898 bp的水牛MBD3基因序列,其中编码区全长774 bp,编码257个氨基酸。通过对MBD3基因核苷酸序列的多重比对及进化树分析,MBD3基因在进化中高度保守,特别是MBD结构域,水牛与牛的同源性为100%,与人、猪、猩猩的同源性均为97%。将水牛MBD3基因真核表达载体转染HEK293T细胞和BFF,通过荧光观察、RT-PCR及Western blotting方法鉴定表明,成功构建了水牛MBD3基因的真核表达载体。本研究克隆得到了水牛的MBD3基因,并成功构建了MBD3基因的真核表达载体,为进一步研究MBD3基因在水牛胚胎发育及iPSCs诱导上的作用奠定了基础。 相似文献
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水牛髓样分化因子88融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达 总被引：1，自引：1，他引：0
将水牛髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)cDNA全长定向克隆至pEGFP-C1真核表达载体,通过酶切和测序鉴定正确后,经脂质体介导将重组质粒转染至HEK293细胞,应用荧光显微镜、流氏细胞术和Western blotting检测MyD88蛋白的表达。结果表明,酶切及测序结果证实重组质粒含有MyD88全长CDS序列,融合蛋白读码正确;荧光显微镜、流式细胞术和Western blotting检测证实,水牛EGFP-MyD88融合蛋白真核表达载体能够在HEK293细胞表达。本研究成功构建了pEGFP-C1-MyD88真核表达载体,并使其在HEK293细胞中获得表达,为进一步研究该基因的生物学功能奠定基础。 相似文献
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本研究旨在克隆奶牛脑肌类芳香烃受体核转位蛋白1基因（Brain and Muscle Arnt-Like Protein 1,BMAL1）的蛋白编码序列（Coding Sequence,CDS）并构建其真核表达载体,运用生物信息学方法解析其CDS序列和编码蛋白特性。以牛肝脏组织为材料,利用PCR技术扩增奶牛BMAL1基因中带有同源臂的CDS片段。采用同源重组法,将目的片段连接至酶切线性化的pc DNA3.1-Puro-N-3HA真核表达载体上,酶切及测序结果均符合预期的质粒命名为pc DNA3.1-3HA-c BMAL1。将空载与重组质粒分别转染至HEK293T细胞,通过实时荧光定量PCR技术（q PCR）和Western Blotting技术检验奶牛BMAL1基因的过表达效果,并利用生物信息学软件分析BMAL1基因CDS区及其编码蛋白的特性和功能。结果显示,pc DNA3.1-3HA-c BMAL1真核表达载体构建成功,将该质粒转染至HEK293T细胞后,成功实现了BMAL1在m RNA和蛋白水平的过表达;牛BAML1基因与绵羊、山羊同源性最高,BMAL1蛋白为不稳定蛋白,其上不存在... 相似文献
4.
本研究旨在对水牛组蛋白去甲基化酶KDM1A基因进行克隆,分析并构建真核表达载体,为研究其在水牛体细胞克隆胚胎中的作用提供基础。首先提取水牛卵巢总RNA,利用RT-PCR技术克隆得到水牛KDM1A基因并对其进行生物信息学分析。结果表明:水牛KDM1A基因编码区全长2 625 bp,预测编码874个氨基酸;水牛KDM1A与其他物种同源性较高且与生物分类学保持一致;其所编码蛋白分子式为C2375H3855N805O776S24,理论分子质量为56 872.11;其二级结构由19个α螺旋,47个β折叠,25个T转角和无规则卷曲组成;其高级结构在水牛、黄牛、人之间具有较高的相似性;本实验构建了水牛pcDNA3.1(+)-KDM1A真核表达载体,转染pcDNA3.1(+)-KDM1A可以显著提高水牛耳部成纤维细胞(BFFs)中KDM1A的表达水平;还发现卵母细胞中KDM1A的表达水平显著高于BFFs。 相似文献
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为了正确表达禽呼肠孤病毒(ARV)σA蛋白,试验拟构建σA基因的真核表达质粒,并将其在人胚肾细胞(HEK293T)中准确表达,参照GenBank中ARV S2基因序列(登录号为KF741763. 1)设计特异性引物,以pMD18-T-σA重组载体为模板,应用PCR的方法扩增σA基因的特异性序列,并将其克隆到p MD18-T载体中,构建重组pMD18-T-σA表达质粒,再用限制性内切酶KpnⅠ和NotⅠ同时双酶切pMD18-T-σA和真核表达质粒pEF1α-HA,将胶回收的σA基因和pEF1α-HA进行连接,构建真核表达质粒pEF1α-HA-σA。真核表达质粒经菌落PCR、双酶切和测序验证正确后,将其转染HEK293T细胞,于24 h后收取蛋白质,通过Western-blot验证目的蛋白。结果表明:本试验成功克隆了ARVσA基因,构建了其真核表达质粒pEF1α-HA-σA,并在HEK293T细胞中表达。说明该蛋白可以在HEK293T细胞中准确表达。 相似文献
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为体外构建NLRP3炎症复合体,利用PCR方法扩增目的基因NLRP3、IL-1β、ASC和Pro-Caspase-1,分别连接到相应的载体中,构建重组真核表达质粒p3XFLAG-NLRP3、pEGFP-C1-ASC、pEGFP-C1-IL-1β、PCI-CASP-HA,利用Lipofectamine2000试剂转染到HEK293T细胞后,采用Western blot方法验证各蛋白的表达情况;通过质粒共转染体外构建NLRP3炎症复合体,采用ELISA方法检测IL-1β生成情况。结果显示,3XFLAG-NLRP3、pEGFP-C1-ASC、pEGFP-C1-IL-1β、PCI-CASP-HA重组质粒均被成功构建,各蛋白于HEK293T细胞内均被成功表达;质粒共转染后ELISA检测到高水平的IL-1β生成,表明NLRP3炎症复合体体外构建成功。NLRP3炎症复合体在体外的成功构建,为进一步研究其激活机制奠定了基础。 相似文献
8.
构建过表达抗禽流感病毒(H5N1)M1蛋白入胞单分子抗体(TAT-ScFv-mFc)的慢病毒载体,筛选获得稳定表达TAT-ScFv-mFc的HEK293T稳转细胞株。PCR扩增目的基因,将其插入质粒pLVX-mCMV-ZsGreen1-Puro中,构建pLVX-TAT-ScFv-mFc-ZsGreen1-Puro慢病毒过表达质粒,对重组质粒进行慢病毒包装后使用转染试剂复合物转染HEK293T细胞系,并使用嘌呤霉素(Puro)筛选阳性表达细胞,经过扩大培养及裂解后,以ProteinG纯化目的蛋白并对蛋白纯品进行鉴定。Western blot检测结果显示,成功获得了稳定表达TAT-ScFv-mFc的HEK293T细胞株。ELISA、SDS-PAGE、BCA结果显示成功获得预期目的蛋白2 mL(0.39 g/L)。结果表明,本研究成功建立了稳定表达抗H5N1病毒抗体的293T细胞系,为进一步研究TAT-ScFv-mFc的功能结构奠定了基础,也同时为真核表达系统的抗体制备研究提供了参考依据。 相似文献
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研究旨在构建具有高效抗菌、活性持久的奶牛乳腺特异性表达质粒,探索研制新型抗菌制剂,为利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供重要材料。根据GenBank中奶牛溶菌酶基因(lysozyme,Lyz)mRNA序列(GenBank号:NM_180999.1)设计引物,从奶牛乳腺上皮细胞中RT-PCR扩增Lyz基因编码序列,将其克隆到携带增强型绿色荧光蛋白通用型表达载体pEGFP-N1中测序。重组质粒pEGFP-N1-Lyz经Ase I+Hind III双酶切除CMV启动子,将奶牛乳腺特异性表达β-乳球蛋白基因(BLG)启动子同源重组替换到Ase I和Hind III酶切位点,构建奶牛溶菌酶基因(Lyz)乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz,采用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)、人肾脏上皮细胞(HEK293T),荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明,重组表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz测序结果与目的片段长度相符,转染至BMEC细胞和HEK293T细胞,在奶牛乳腺上皮细胞观察到绿色荧光, HEK293T细胞未观察到绿色荧光,奶牛Lyz基因乳腺特异性表达质粒构建成功。 相似文献
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为了阐明Smad4基因在水牛卵巢颗粒细胞增殖及胚胎发育中的分子机制,试验采用RT-PCR扩增并克隆水牛Smad4基因,对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,构建Smad4基因的真核表达载体,通过脂质体转染法转染体外培养的牛卵巢颗粒细胞。结果表明,试验克隆得到水牛Smad4基因编码序列,编码区全长为1 662 bp,编码553个氨基酸。通过BLAST对水牛Smad4基因的核苷酸序列进行同源性比对,结果显示,水牛Smad4基因与牛的同源性为99%,与绵羊、猪、马、人的同源性分别为98%、96%、96%和95%。系统进化树分析表明,Smad4基因在不同物种的进化过程中具有高度的保守性。试验成功构建了水牛Smad4基因的真核表达载体pEGFP-N1-Smad4,并在水牛卵巢颗粒细胞中表达出较强的绿色荧光蛋白Smad4-EGFP融合蛋白。本研究成功克隆了水牛Smad4基因,并成功构建了Smad4基因的真核表达载体,为进一步研究Smad4基因在水牛胚胎发育过程中的分子机制奠定基础。 相似文献
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LIU Yi MA Li-peng LI Tao LI Meng-xun SHENG Yong-qiao HUANG Tao HU Jiu-ying WANG De-ming WANG Xin LAI Hong-xia 《中国畜牧兽医》2017,44(1):123-130
To study the influence of estrogen receptor (ESR), osteopontin (OPN) and retinol binding proteins 4 (RBP4) genotypes on reproductive performance of Yorkshire sows, PCR-RLFP technique was used for genotyping, and the effects of genotypes on reproductive traits were analyzed. The results showed that A allele of ESR and OPN genes were predominant allele, and B allele of RBP4 gene was predominant allele. TNB,NBA of ESR gene AB and BB genotypes were higher than AA genotype;TNB of OPN gene AA genotype was the highest, but the NBA, NHB and WB for OPN gene genotypes were BB > AA > AB;The TNB,NBA,NHB and WB for RBP4 gene genotypes were AA > BB > AB. Then combing genotype analysis showed that ABAA of ESR-RBP4 and BBAA of OPN-RBP4 were the most prolific alleles, respectively. The present data revealed that ESR, OPN and RBP4 genes polymorphisms were associated with reproductive performance of Yorkshire sows. 相似文献
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为了建立猪源大肠杆菌对氟苯尼考、β-内酰胺类与粘杆菌素耐药基因的多重PCR检测方法,本研究以氟苯尼考耐药基因floR、β-内酰胺耐药基因CTX-M、粘杆菌素耐药基因mcr-1作为目的基因,设计3对特异性引物,通过对多重PCR反应体系及条件的优化,成功建立了多重PCR检测方法。该方法的灵敏度为1.46×10^5CFU/m L,具有高度特异性、敏感性和可重复性。本方法的建立为大肠杆菌中常见耐药基因的快速检测及分子流行病学调查提供了新的手段。 相似文献
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不同猪种肉质相关基因Hal、RN和FTO的多态性研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为了明确肉质相关基因氟烷基因(Hal)、酸肉基因(RN)和脂肪肥胖相关基因(FTO)在国内外不同猪种群体间的遗传变异特性,本研究以大约克、长白、杜洛克和金华猪等猪种群体为研究对象,应用PCR-RFLP技术分别检测了Hal、RN和FTO基因的多态性,并分析了FTO基因上2个多态位点g.276G＞T和c.594C＞G的遗传变异情况.结果表明:(1)在杜洛克猪中发现了Hal的基因型HalN Haln,其频率为0.166,但未发现基因型Haln Haln,其它猪种群体中仅检测到了基因型HalN HalN;(2)在已检测的所有猪种群体中只检测到RN基因的rn/rn基因型,未发现rn/RN和RN/RN基因型;(3)在FTO的g.276G＞T位点上,金华猪呈现单态,其它猪种群体均呈现多态.在FTO的c.594C＞G位点上,4个猪种群体均呈现多态,3个外来猪种群体均以CC基因型频率较高,而金华猪则以GG基因型频率较高.研究结果提示,由于Hal基因在养猪生产中的利弊双重性,因此在某些猪种群体中仍然存在较高频率的HalN Haln基因型.此外,结合FTO基因的生理功能和已有的研究结果,可在特定的猪群中将其作为影响猪肉质性状的候选基因.本研究发现FTO的基因型分布在我国优良地方猪种金华猪与国外3个种猪群间存在较大差异,为深入研究不同品种猪的肉质形成机理提供了基础数据. 相似文献
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【目的】构建布鲁氏菌BPE159基因缺失株,研究缺失株体外生长变化特征及其在宿主细胞中的存活能力,探究布鲁氏菌感染期间分泌蛋白BPE159对自噬因子表达的影响。【方法】同源重组方法构建布鲁氏菌BPE159基因重组质粒,电转化布鲁氏菌S2308感受态细胞构建BPE159基因缺失株S2308ΔBPE159。PCR扩增BPE159基因,连接转化构建pBBR1MCS-4-BPE159载体,提取质粒进行电转化,构建BPE159基因回补株S2308ΔBPE159-C。琼脂糖凝胶电泳检测缺失株和回补株遗传稳定性。构建布鲁氏菌感染小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,实时荧光定量PCR检测布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子ATG5、Beclin1、LC3a和LC3b基因表达水平。以S2308、S2308ΔBPE159和S2308ΔBPE159-C株侵染小鼠巨噬细胞,收集细胞总RNA,实时荧光定量PCR检测BPE159基因缺失对布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子表达水平的影响。在相同起始浓度下培养S2308、S2308ΔBPE159及S2308ΔBPE159-C株,观察细菌生长变化趋势;评价S2308ΔBPE159株在不同... 相似文献
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鸽GnIH和GnRH基因克隆及其在不同繁殖阶段下丘脑中的表达 总被引：1，自引：1，他引：0
为研究促性腺激素抑制激素（gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH）和促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone,GnRH）基因在鸽繁殖不同阶段下丘脑组织中的表达变化,探讨GnIH和GnRH基因与鸽繁殖调控之间的关系,本研究以鸽cDNA为模板扩增GnIH和GnRH基因CDS区序列并进行克隆测序,采用实时荧光定量PCR技术检测了产蛋前、产蛋后及哺乳期鸽下丘脑组织中GnIH和GnRH基因mRNA表达水平。序列分析结果表明,鸽GnIH基因CDS区全长522 bp,已提交GenBank,登录号：MG589638,编码173个氨基酸,与已知其他鸟类GnIH同源性达85%以上;鸽GnRH基因CDS区全长276 bp,已提交GenBank,登录号：MG589639,编码91个氨基酸,与已知其他鸟类GnRH同源性达80%以上。鸽GnIH前体包含1个GnIH和2个GnIH相关肽（GnIH-RP-1、GnIH-RP-2）,具有典型的"LPXRF"基序;GnRH前体包含1个信号肽、1个GnRH和1个GnRH相关肽（GAP）。实时荧光定量PCR结果表明,产蛋前鸽下丘脑中GnIH基因表达量最高,且极显著高于产蛋后和哺育期（P<0.01）;产蛋后鸽下丘脑中GnRH基因表达量最高,且极显著高于产蛋前和哺育期（P<0.01）;产蛋前鸽下丘脑中GnIH基因表达量极显著高于GnRH基因（P<0.01）,而产蛋后和哺育期鸽下丘脑中GnRH基因表达量极显著或显著高于GnIH基因（P<0.01;P<0.05）。结果表明,GnIH和GnRH基因的表达与母鸽不同繁殖阶段的转变有关,为进一步研究鸽繁殖分子机制奠定基础。 相似文献
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为了探讨雌激素受体（estrogen receptor,ESR）、骨桥蛋白（osteopontin,OPN）和视黄醇结合蛋白4（retinol binding proteins 4,RBP4）的多态性对大白猪繁殖性状的影响,本研究采用PCR-RFLP技术检测试验猪群ESR、OPN和RBP4基因的多态性,并分析其对大白猪总产仔数、产活仔数、健仔数、窝重、初生重、死胎、木乃伊、弱仔数和畸形数等性状的影响。结果显示,在大白经产母猪中,ESR和OPN基因的优势基因为A等位基因,RBP4基因的优势基因为B等位基因;ESR基因AB与BB基因型在总产仔数、产活仔数性状上均高于AA基因型;OPN基因在总产仔数性状上AA基因型最高,在产活仔数、健仔数、窝重性状上均为BB > AA > AB;RBP4基因在总产仔数、产活仔数、健仔数、窝重性状上均为AA > BB > AB;合并基因型分析发现ESR-RBP4最优的分子标记组合为ABAA;OPN-RBP4最优的分子标记组合为BBAA。因此,ESR、OPN和RBP4基因多态性与大白猪繁殖性状相关。 相似文献
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试验旨在利用qPCR 技术对热休克同源蛋白（HSC70）、热休克蛋白70.1（HSP70.1）和热休克转录因子1（HSF1）基因在乐至黑山羊和藏山羊五个组织样中的表达量进行研究,以探讨热休克蛋白家族70（HSP70）与山羊生态适应性的关系。结果表明,HSC70 mRNA在藏山羊心脏中的表达量是乐至黑山羊中的4.5倍(P<0.05),但在脑垂体中乐至黑山羊的表达量是藏山羊的3.7倍(P<0.05),在卵巢、肝脏和子宫中两品种间无显著差异;HSF1 mRNA在藏山羊卵巢、心脏中的表达量分别是乐至黑山羊的7.9倍和3.1倍(P<0.05),在肝脏和子宫中乐至黑山羊的表达量却分别是藏山羊的6.3倍和10.4倍 (P<0.05);HSP70.1 mRNA在乐至黑山羊脑垂体中的表达量是藏山羊的6.8倍 (P<0.05)。说明HSC70、HSP70.1和HSF1基因的表达与山羊的生活环境及饲养方式有一定的关系。 相似文献
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为研究融合表达肿瘤靶向肽(RGD)和蜂毒肽(MEL)双基因重组减毒沙门氏菌对小鼠黑色素瘤B16细胞的体外抑瘤作用,本实验将RGD-MEL基因片段克隆至pEGFP-N1载体,将重组载体导入减毒沙门氏菌LH430,构建了重组沙门氏菌LH430/pEGFP-RGD-MEL,经PCR技术、质粒双酶切鉴定后采用阳性重组菌株侵染体外培养的小鼠黑色素瘤B16细胞,提取细胞总RNA经反转录后采用PCR检测目的基因RGD-MEL转录情况,western blot检测目的蛋白RGD-MEL以及凋亡蛋白Caspase-3、Bcl2、Bax的表达;流式细胞术检测B16细胞凋亡情况。结果显示:导入RGD-MEL基因的减毒沙门氏菌LH430侵染B16细胞后,目的基因RGD-MEL高效表达;经重组菌株侵染的B16细胞凋亡蛋白Caspase-3、Bcl2、Bax表达水平均显著增高(p<0.05);重组沙门氏菌诱导B16细胞的凋亡作用较PBS组显著增强(p<0.05)。本研究为细胞穿膜肽和细菌联合治疗肿瘤提供实验支持,并为后续动物试验奠定了研究基础。 相似文献
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Identification of internal control genes in milk‐derived mammary epithelial cells during lactation cycle of Indian zebu cow 
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下载免费PDF全文 Pradeep Jatav Monika Sodhi Ankita Sharma Sandeep Mann Amit Kishore Umesh K Shandilya Ashok K Mohanty Ranjit S Kataria Poonam Yadav Preeti Verma Surinder Kumar Dhruba Malakar Manishi Mukesh 《Animal Science Journal》2016,87(3):344-353
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为研究急性冷应激通过影响热休克蛋白含量的变化对阿勒泰羊抗寒性能、生产性能及抗病性能等的影响,试验设置常温组（15 ℃±2 ℃）与冷应激组（-25 ℃±2 ℃）,每组各5只羊,屠宰后分别采集急性冷应激组（冷应激24 h后）和常温组的心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织。采用实时荧光定量PCR技术对HSP60、HSP70和HSP90 mRNA含量变化进行检测,并对HSP60、HSP70和HSP90基因进行同源性分析。结果显示,HSP70和HSP90基因与已有绵羊序列同源性高于99%,而HSP60基因与已有波斯金牛序列同源性高于99%;冷刺激后HSP60基因在心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织中的表达较常温组均升高,且在肾脏中的表达量差异极显著（P<0.01）;冷刺激后HSP70基因在心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织中的表达较常温组均升高,且在肝脏和肾脏组织中的表达量差异极显著（P<0.01）;冷刺激后HSP90基因在心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织中的表达较常温组均升高,且在肝脏组织中表达量差异显著（P<0.05）,而在脾脏和肾脏组织中的表达量差异极显著（P<0.01）。表明急性冷应激极大程度地刺激了机体的产热机能,通过通路中的产热相关基因的相互调节使其能量代谢发生改变,从而提高细胞生存率,增强机体对环境胁迫的耐受力,能更好地适应环境温度的变化。试验结果为进一步深入研究急性冷应激对阿勒泰羊机体的影响提供一定理论依据。 相似文献