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1.
提取经植物血凝素诱导培养的梅花鹿外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出梅花鹿γ-干扰素成熟蛋白基因,经克隆测序表明与GenBank上发表的干扰素序列同源性为100%。将其重组到含有CMV增强子的真核表达载体质粒pCI-neo上。利用磷酸钙介导转染法将重组载体质粒pCI-neo-CerIFN-γ转染入中国仓鼠肾细胞(BHK-21)和牛肾细胞(MDBK)中,在G418抗性压力下进行筛选培养获得了稳定分泌表达的转染细胞系。通过Western blotting检测确定表达产物的相对分子质量分别为23、20、16ku,与预测大小一致。本研究成果为进一步开发梅花鹿生物制品类治疗制剂奠定了基础。 相似文献
2.
《中国兽医学报》2016,(12):2049-2053
采用基因工程技术克隆出梅花鹿α干扰素(IFN-α)成熟肽基因序列,并将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.0(+),经酶切、PCR及测序鉴定,成功构建了pcDNA3.0-IFN-α真核重组表达质粒。将鉴定正确的阳性重组质粒经非脂质体法转染至MDBK细胞,间接免疫荧光试验检测其具有较高转染效率;Western blot法检测IFN-α蛋白在MDBK细胞中得到有效表达;病变抑制试验检测转染后的MDBK细胞具有明显抗BVDV活性;抗BVDV活性的定量试验表明转染pcDNA3.0-IFN-α质粒的MDBK细胞与感染未转染的MDBK细胞相比抗BVDV活力提高了66192倍。本试验在MDBK细胞中成功表达了梅花鹿IFN-α,并检测出其具有明显抗BVDV作用,这为梅花鹿IFN-α活性机理研究以及开发更高效的抗梅花鹿病毒性疾病干扰素制剂提供物质和理论基础。 相似文献
3.
《中国预防兽医学报》2016,(11)
为真核表达梅花鹿干扰素β1(IFN-β1)并检测其抗牛病毒性腹泻病毒(BVDV)活性,本研究以梅花鹿肝脏基因组为模板,通过PCR扩增出IFN-β1的编码区序列,克隆于真核表达载体pVAX1中,构建重组真核表达质粒pVAX1-IFNβ1,并转染MDBK细胞进行表达。结果显示,将pVAX1-IFNβ1转染MDBK细胞后经western blot和间接免疫荧光法检测和鉴定证实,转染的重组质粒能够在MDBK细胞中正确表达目的蛋白,表达的重组蛋白约为25 ku。此外,采用细胞病变抑制法检测表明转染后重组细胞表达的IFN-β1具有抗BVDV活性。本研究为梅花鹿IFN-β1蛋白抗病毒分子机制的研究及抗病毒药物的开发奠定了基础。 相似文献
4.
梅花鹿γ干扰素克隆表达及抗病毒活性测定 总被引：1，自引：1，他引：1
提取经植物血凝素诱导培养的梅花鹿外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出梅花鹿γ干扰素成熟蛋白基因并将其克隆到pMD18-T载体上,测序结果表明,扩增片段为梅花鹿γ干扰素成熟蛋白序列,与GenBank上发表的干扰素序列同源性为100%.将其重组到原核表达载体pET32a(+)上,并在大肠埃希菌BL21中实现了高效表达.表达产物以His-Tag融合蛋白的形式存在,表达量约占细菌总蛋白的32.6%.用镍亲和层析法对蛋白进行纯化,并利用VSV-MDBK/IBRV细胞系统分析其生物活性,重组梅花鹿γ干扰素抗病毒活性分别约为7.25×104 U/mL和4.61×104 U/mL.结果表明,重组梅花鹿γ干扰素特异性好,而且抗病毒活性比较稳定. 相似文献
5.
6.
为了研究PCV2ORF2的不同抗原表位重组PPVVP2基因真核表达质粒的体外表达情况与免疫原性,分别以PCV2SC株和PPVSC-1株为模板,扩增PCV2ORF2的抗原表位基因A、B、c（A：117～131aa,B：157～183aa,C：165～200aa）和PPVVP2基因。将A、B、C基因分别与PPVVP2基因串联,并插入到pCI真核表达载体中,构建了能同时表达PPVVP2蛋白和PCV20RF2抗原表位的重组质粒pCI—A—VP2、pCI13-Vp2、pCI—C—VP2。将重组真核表达质粒转染MDBK细胞,用间接免疫荧光试验检测各个质粒在细胞中的表达情况;并将其免疫小鼠,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法检测免疫效果。结果显示,3种重组表达质粒转染细胞48h后都能检测到较强的免疫荧光;免疫小鼠后14～42d诱导的T淋巴细胞转化效率、CD4＋／CD8＋细胞比值以及PPV和PCV2抗体均显著高于对照组,且pCI—13-VP2免疫效率高于其他组。该结果表明PCV2ORF2上157～183aa抗原表位在3个抗原表位中抗原性最强,可作为PCV2与其他病毒二联疫苗研究的主要抗原表位。 相似文献
7.
《黑龙江畜牧兽医》2014,(15)
为了构建鸡α干扰素基因真核表达载体,试验采用RT-PCR方法从鸡胚成纤维细胞中扩增α干扰素基因序列,将扩增产物定向插入到pMD18-T克隆载体中,进行序列测定;测序正确的质粒经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切,将目的基因片段定向克隆到真核表达载体pCAGGS中,构建重组质粒pCAGGS-IFN-α;将重组质粒转染293T细胞,使用间接免疫荧光、Western-blot等方法检测目的蛋白。结果表明:已成功扩增出582 bp大小的鸡α干扰素基因片段,测序结果与GenBank报道的序列基本一致。说明阳性重组质粒pCAGGS-IFN-α真核表达载体构建成功,能正确表达鸡α干扰素。 相似文献
8.
为合成与天然构象相似的干扰素γ蛋白,通过优化干扰素序列的密码子序列,利用杆状病毒表达系统合成真核重组牛IFN-γ蛋白。实验化学合成牛IFN-γ基因,并将该基因克隆至真核表达载体pFastBacHTA中,将构建成功的重组载体与DH10Bac感受态大肠杆菌进行转座形成穿梭载体,穿梭载体质粒瞬时转染至SF9昆虫细胞中,获得重组杆状病毒,最后利用SF9昆虫细胞悬浮培养大量表达目的蛋白。蛋白纯化后经Western Blotting和BOVIGAM牛分枝杆菌IFN-γELISA检测试剂盒检测分析,具有较好的免疫原性和反应原性。研究结果为牛IFN-γ的单克隆抗体制备以及牛结核病临床诊断奠定了基础。 相似文献
9.
以人肝cDNA为模板克隆了人血小板生成素（Human Thrombopoietin,hTPO）基因,利用基因重组技术构建了带有新霉素抗性基因（neo）筛选标记的pcDNA3.1(+)-hTPO真核表达载体,将重组质粒瞬时转染293T细胞,用鼠抗人TPO 单抗Western blot 检测 TPO蛋白的瞬时表达;再将重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO),应用400 μg/mL的G418筛选克隆,经PCR及Western blot验证,获得了3株hTPO蛋白表达水平不同的CHO细胞系,为获得大量蛋白并进行活性功能试验及临床应用奠定基础。 相似文献
10.
采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)SC-H株S基因5′端主要抗原位点片段和N基因,插入pMD19-T载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒19T-N与19T-S.从T载体上将S、N基因切下,以亚克隆方法插入真核表达载体pVAX1,构建嵌合表达S、N基因的重组质粒pVAX-S-N.对重组质粒PCR与酶切鉴定后,以脂质体转染法转染COS7细胞,间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达情况.结果表明,重组质粒构建正确且在COS7细胞中得到表达,转染的细胞呈现特异性荧光.真核表达质粒pVAX-S-N的成功构建为进一步研究TGEV核酸疫苗奠定了物质基础. 相似文献
11.
为表达具有抗病毒活性的梅花鹿干扰素β1(IFN-β1),本研究通过PCR扩增梅花鹿IFN-β1基因,将其克隆至原核表达载体p ET-28a中,构建重组质粒p ET-IFNβ1,并将其转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后,得到高效表达。SDS-PAGE与western blot分析结果表明,梅花鹿IFN-β1重组蛋白的分子量大小约为24 ku,表达产物主要为不溶性的包涵体,表达量占菌体总蛋白的59.02%。将Ni柱纯化的p ET-IFNβ1诱导表达产物复性后,细胞病变抑制法检测表明表达产物具有抗病毒活性,其抗病毒活性可以达到10×53.81U/0.1 m L。梅花鹿INF-β1的表达为梅花鹿INF-β1的应用奠定了基础。 相似文献
12.
《畜牧与兽医》2014,(11):6-9
研究非病毒载体多聚左旋赖氨酸(PLL)与猪干扰素α(PIFNα)重组质粒的聚合物PLL-pVAX1-PIFNα对PRRSV弱毒疫苗诱导产生中和抗体的影响。本文首先构建了猪干扰素α真核表达质粒pVAX1-PIFNα,并将此重组质粒在293T细胞中转染,经Western blot验证PIFNα在细胞上清中分泌表达;将pVAX1-PIFNα与PLL以适当的比例聚合后,联合PRRSV弱毒疫苗免疫动物,应用ELISA抗体试剂盒检测PRRSV抗体的水平。结果表明:联合聚合物PLL-pVAX1-PIFNα注射免疫组的抗体水平明显高于其他各组,说明PLL与pVAX1-PIFNα表达质粒的聚合,显著提高了pVAX1-PIFNα表达质粒联合PRRSV弱毒疫苗免疫后诱导机体产生抗体的能力。 相似文献
13.
Viperin是一种细胞内抗病毒蛋白,可以被I型干扰素、多聚I:C、脂多糖及多种病毒诱导表达,在细胞内主要定位在内质网和脂滴,具有广谱的抗病毒功能。为研究马Viperin(eViperin)在抗病毒感染中的作用,本研究应用RT-PCR从马巨噬细胞中扩增eViperin基因,并将其克隆于真核表达载体pDC315中构建重组质粒pDC-eViperin-Flag,将重组质粒转染293T细胞,western blot检测结果表明eViperin在293T细胞中正确表达。将该重组表达质粒与表达马传染性贫血病毒(EIAV)Gag前体蛋白(Gag precursor,Pr55gag)的表达质粒共转染293T细胞,转染48 h后western blot检测,结果显示实验组细胞培养上清中的Pr55gag含量显著低于空白对照组,表明eViperin具有抑制EIAV释放的作用。此外,将该重组表达质粒与腺病毒骨架质粒pBHGlox△E1,E3Cre共转染HEK293细胞,进一步构建拯救出表达eViperin的重组腺病毒,为研究eViperin的抗病毒功能研究奠定了基础。 相似文献
14.
构建了携带绵羊朊蛋白基因（PRNP）的重组真核转染质粒,通过脂质体转染试剂将其转染至神经胶质瘤细胞（C6）,以期为进一步研究绵羊朊蛋白的生理功能和从细胞水平研究朊蛋白疾病的发病机制奠定基础。采用PCR扩增目的基因序列,纯化后将其克隆到带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,对重组质粒pEGFP-PRNP做酶切鉴定。而后采用阳离子脂质体转染法将重组质粒转染到C6细胞,荧光显微镜观察。经鉴定,绵羊PRNP基因已克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,成功地构建了重组pEGFP-PRNP质粒,并可稳定地在C6细胞中表达。本研究为外源朊蛋白在细胞中表达提供了平台,为进一步在细胞水平研究朊病毒疾病奠定了基础。 相似文献
15.
16.
采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒（TGEV）SC-H株S基因N端主要抗原位点片段（大小约为1 916bp）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）SC-L株S1基因（大小约为2 367bp）,插入pMDl9-T simple载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒pMD19-T-TS与pMD19-T-PS1。从T载体上将PS1、TS基因切下,以亚克隆方法插入双启动子真核表达载体pVAXD,构建能同时表达TGEV S基因和PEDV S1基因的重组质粒pVAXD-PS1-TS。对重组质粒进行PCR与酶切鉴定后,以脂质体转染法转染COS7细胞,间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达情况。结果表明,重组质粒构建正确且能够在COS7细胞中得到表达,转染的细胞呈现特异性荧光。真核表达质粒pVAXD-PS1-TS的成功构建为进一步研究PEDV和TGEV的二联核酸疫苗奠定了基础。 相似文献
17.
为了构建猪囊尾蚴（Cysticercuscellulosae）热休克蛋白的真核表达载体,试验利用PCR技术扩增HSP35．6的基因,将其与增强型绿色荧光蛋白的基因先后连接到pVAXI真核表达载体上,得到pVAXI—HSP35．6-EGFP的重组质粒,经酶切及测序鉴定正确。采用脂质体介导的DNA转染法,将阳性重组质粒转染Vero细胞。转染48h后荧光显微镜下观察到明亮的绿色荧光,说明融合基因可在Vero细胞中高效表达。本研究为进一步研究该蛋白生物学功能奠定了基础。 相似文献
18.
将猪白介素4(Porcine interleukin4,PIL-4)基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组表达质粒pEGFP-PIL-4,利用脂质体法转染CHO-K1细胞,采用荧光显微镜实时观察、RT-PCR和Western-blot分别检测CHO细胞转录表达目的分子的情况,通过MTT法检测所表达蛋白的生物学活性。结果在将重组质粒转染CHO-K1细胞中24、48 h后的均观察到绿色荧光;经G418筛选14~20 d后转染的细胞形成了阳性细胞集落,用RT-PCR扩增出约339 bp的目的基因片段;经Western-blot检测到约为39 000的特异蛋白分子条带,并证明在转染重组质粒的细胞中表达了高生物活性的重组蛋白。 相似文献
19.
将除去3'端跨膜区的猪瘟病毒E2基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,获得重组质粒pFBHT-E2,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,发生转座作用,经抗性及蓝白斑筛选得到含E2基因的重组载体质粒rBacmid-E2,以脂质体介导的方法将此重组载体质粒转染sf9昆虫细胞,获得重组病毒,命名为rvBac-E2.经SDS-PAGE和Western-blot及ELISA等方法检测,结果表明,此E2基因在昆虫细胞中正确表达,表达的蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应. 相似文献
20.
猪圆环病毒Ⅱ型Rep基因在PK15细胞中的表达及特性 总被引：3，自引：1，他引：3
为研究猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)Rep基因在PK15细胞中的表达特性，通过PCR方法克隆了PCV2杭州株(HZ0201)Rep基因全长945bp片段，与真核表达栽体pCI—neo构建为重组质粒pCI-PCV2-Rep。pCI-PCV2-Rep质粒转染PK15细胞后48h，通过RT-PCR可检测到PCV2 Rep mRNA的转录；用猪PCV2多抗血清作间接免疫荧光试验，可检测到Rep基因表达产物。在表达量低的细胞中，PCV2 Rep蛋白主要位于PK15的细胞浆，在表达量高的细胞中，细胞浆和细胞核中均含有大量的Rep蛋白，表明Rep对PK15细胞的细胞浆和细胞核的亲嗜性没有明显差别。 相似文献