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1.
鸡传染性支气管炎病毒分离株核衣壳基因克隆、序列分析和真核表达 总被引：2，自引：0，他引：2
根据GenBank公开序列自行设计一对引物，采用RT—PCR扩增出鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）W和C9001分离株完整的核衣壳（N）基因，并将其克隆至pMD18-T载体进行核苷酸序列测定和分析。结果表明，扩增的2个IBV分离株核衣壳基因片段长度均为1230bp，编码409个氨基酸，彼此间核苷酸和氨基酸同源性分别为88．0％和89．5％，与GenBank中有代表性的参考毒株相应基因核苷酸和氨基酸序列比较显示，w株核苷酸序列与GenBank中的广东分离株（AY646283）同源性最高，为94．1％，氨基酸序列同源性为94．6％；与国内部分毒株核苷酸序列同源性在86．1％～88．0％之间，氨基酸序列同源性在88．0％～90．7％之间；C9001株与国内部分毒株核苷酸序列同源性在86．4％～99．8％之间，氨基酸序列同源性在88．0％～99．8％之间。从核衣壳基因编码的氨基酸序列的系统进化树可见，W株与C9001株处于不同的进化分枝，亲缘关系较远。同时将核衣壳基因构建于真核表达质粒pVAX1中，用脂质体法将重组质粒转染入COS-7细胞中，间接免疫荧光检测出核衣壳蛋白的体外表达。研究结果为进一步研究IBV核衣壳蛋白的结构与功能以及基因工程疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
2.
6株猪圆环病毒2型流行毒株全基因组克隆及序列分析 总被引：4，自引：0，他引：4
参考GenBank发表的PCV-2全基因组序列,设计1对引物,通过反向PCR技术扩增出6株PCV-2流行株的全基因,并进行了序列测定分析。结果表明,6个分离株基因组全长为1 768 bp或1 767 bp,同源性比较发现,分离株之间的核苷酸同源性为95.5%~100%,与GenBank上已发表的PCV-2分离株之间的同源性为93.0%~100%,与法国分离株同源性最高。6株分离株的ORF2核苷酸及其所推导的氨基酸序列同源性分别为92.9%~100%和92.3%~100%,存在较大的变异。 相似文献
3.
为研究当前流行的新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）基因型、致病性及其与传统新城疫病毒疫苗株（La Sota等）的核苷酸差异,试验从某发病鸡场病死鸡体内分离到1株疑似NDV毒株,经红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）初步确定为鸡源NDV。参照GenBank公布的NDV F基因部分片段（登录号：JF950510.1）设计1对引物,通过RT-PCR技术扩增分离株的F基因并克隆、测序,测序结果与NCBI中NDV F基因序列进行比对,构建系统进化树并分析其基因型;通过测定鸡胚平均致死时间（MDT）、1日龄鸡脑内致病指数（ICPI）和6周龄鸡静脉致病指数（IVPI）判断病毒致病性;参照GenBank公布的NDV全基因组序列（登录号：JF950510.1）设计9对引物对分离株进行全基因组序列测定,并分析其基因组结构。结果表明,RT-PCR扩增得到F基因长约500 bp,基于F基因构建的系统进化树显示分离株为基因Ⅶ型NDV;MDT、ICPI和IVPI分别为52.8 h、1.675和2.46,表明分离株属于强毒株。全基因组序列分析显示,分离株全基因组全长15 192 bp,与传统La Sota株基因组相比,序列多出6个碱基,核苷酸序列同源性82.8%。本研究成功分离到1株基因Ⅶ型NDV强毒株,且与传统疫苗毒株La Sota的核苷酸序列同源性差异较大。 相似文献
4.
兔出血症病毒CD株衣壳蛋白(VP60)基因的克隆、核酸及氨基酸序列比较分析 总被引：6，自引：0，他引：6
以兔出血症病毒 CD株人工感染家兔 ,发病死亡后 ,取肝脏匀浆 ,用 Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒 RNA。根据 Gen Bank已发表序列保守区设计并合成引物 ,采用 RT- PCR方法扩增了 RHDV衣壳蛋白 VP6 0基因。将所扩增片段克隆到 p MD18- T载体上 ,并进行了序列测定 ,测序结果表明 ,CD株 VP6 0基因全长 174 0 bp。该序列与已发表的其他分布于世界各地的 14株 RHDV序列进行了比较和基因进化树分析。无毒株与各强毒株之间的同源性为 85 .3%～86 .5 % ,强毒株间的同源性较高 ,为 92 .1%～ 10 0 %。根据进化树可把强毒株分为 2大群 ,一群为 CD株、Iowa2 0 0 0株、0 0 - 139株、99- 0 5株 ,其余的为另一群。进一步细分 ,还可以分为 4个亚群和 7个组。但毒株之间的地域性差异并不明显。同时根据 15株 RHDV VP6 0基因的核苷酸序列推导了其所编码的氨基酸序列 ,并进行氨基酸序列的比较和亲水性、柔性区、抗原性和表面结构的比较分析。结果显示 ,各毒株氨基酸之间的的同源性在 90 .5 %～ 10 0 %之间 ,其中无毒株与各强毒株之间的同源性为 90 .5 %～ 91.9% ,强毒株间的同源性在 95 %～ 10 0 %之间 ;氨基酸变异分析未发现突变造成的 VP6 0蛋白高级结构的根本性变化 相似文献
5.
为研究当前流行的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基因型、致病性及其与传统新城疫病毒疫苗株(La Sota等)的核苷酸差异,试验从某发病鸡场病死鸡体内分离到1株疑似NDV毒株,经红细胞凝集试验(HA)和红细胞凝集抑制试验(HI)初步确定为鸡源NDV。参照GenBank公布的NDV F基因部分片段(登录号:JF950510.1)设计1对引物,通过RT-PCR技术扩增分离株的F基因并克隆、测序,测序结果与NCBI中NDVF基因序列进行比对,构建系统进化树并分析其基因型;通过测定鸡胚平均致死时间(MDT)、1日龄鸡脑内致病指数(ICPI)和6周龄鸡静脉致病指数(IVPI)判断病毒致病性;参照GenBank公布的NDV全基因组序列(登录号:JF950510.1)设计9对引物对分离株进行全基因组序列测定,并分析其基因组结构。结果表明,RT-PCR扩增得到F基因长约500bp,基于F基因构建的系统进化树显示分离株为基因Ⅶ型NDV;MDT、ICPI和IVPI分别为52.8h、1.675和2.46,表明分离株属于强毒株。全基因组序列分析显示,分离株全基因组全长15 192bp,与传统La Sota株基因组相比,序列多出6个碱基,核苷酸序列同源性82.8%。本研究成功分离到1株基因Ⅶ型NDV强毒株,且与传统疫苗毒株La Sota的核苷酸序列同源性差异较大。 相似文献
6.
根据GenBank中猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因的核苷酸序列，设计了1对特异性引物。采用此引物从PCV2疑似病料的3个样品中扩增出了0RF2片段。将扩增片段克隆入pMD18-T载体中，筛选获得了含有相应片段的阳性重组质粒pMDHB—ORF2。对质粒中的插入片段测序后，应用DNAStar序列分析软件，对所测PCV2序列与GenBank中的国内外PCV毒株进行了同源性比较。结果，3个样品间ORF2基因的核苷酸同源性为100％；它们与浙江分离株之间核苷酸序列的同源性极高，达99．5％。 相似文献
7.
利用分子生物学技术对高原鼠兔感染皮蝇蛆16SrRNA基因进行了研究,扩增出长度为551 bp的序列,克隆测序,将其序列与GenBank中的皮蝇科、胃蝇科的序列进行了聚类分析,并构建分子进化树.结果显示,感染高原鼠兔的皮蝇蛆与皮蝇科的皮蝇蛆遗传距离更近,在一个大的进化树分支上,基因片段同源性84.6％～88.4％之间,与胃蝇科的红尾胃蝇基因片段同源性60.1％ ～64.4％之间.几株感染高原鼠兔的皮蝇蛆之间的基因片段同源性94.4％～99.6％之间. 相似文献
8.
为研究上海地区犬感染细小病毒（Canine parvovirus,Cpv）的基因特点和基因型,参考GenBank上细小病毒3个基因型的全基因设计6对扩增引物进行PCR,分段扩增出目标片段,克隆于T载体上,测定序列并拼接,用MEGA软件、NJ法构建进化树。结果显示,犬细小病毒全基因为4758bp,命名为CPV-SH．提交到GenBank上的序列号为FJ792845,与GenBank中4神基因型爽细小病毒的VP2基因核苷酸序列同源性比较发现,CPV-SH克隆与2a亚型犬细小病毒核苷酸同源性为最高99．7％,与2型、2b亚型。2e亚型的同源性分别为98．8％、99．5％．99．5％。CPV-SH属于2a亚型犬细小病毒,与国内北京分离株CPV／BJ082亲缘关系最近,同源性为99．9％。 相似文献
9.
基因Ⅶ型鹅副粘病毒NA-1株全基因组的克隆及特性分析 总被引：3，自引：5，他引：3
将本实验室分离保存的NA-1株鹅副粘病毒（GPMV）经SPF鸡胚增殖，收集鸡胚尿囊液进行病毒纯化，提取病毒基因组RNA。参考GenBank已收录的GPMV ZJ1株基因组序列，设计了8对特异性引物，RT—PCR法分别特异性的扩增出病毒各基因片段，并将各目的基因片段回收纯化．克隆PGEMT载体．转化大肠杆菌DH5α，小提质粒选取阳性克隆酶切鉴定并进行序列测定．对测定结果进行拼接得到全长cDNA序列（GenBank登录号：DQ659677）。NA-1株核苷酸比新城疫病毒（NDV）核苷酸多6个碱基，位于1644～1645nt之间，符合NDV核苷酸“六碱基原则”。序列分析结果表明，GPMVNA-1株与各地代表株核苷酸同源性81．2％～91．3％。同时根据各毒株F基因开放阅读框前389个核苷酸序列绘制出系统发育进化树，结果表明GPMNNA-1株与SFO2和QY97病毒株同属于基因Ⅶ型，不同于基因Ⅸ型NDV的国家标准株F48E9和基因Ⅱ型的LaSota传统弱毒株。 相似文献
10.
参照国外发表的猪Ⅱ型圆环病毒（PCV2）全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,从山东疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）病料中提取PCV2基因组DNA,进行PCR扩增。回收PCR产物,将其插入pMD18-T载体,构建了重组质粒pMD18TPCV2,并对筛选出的阳性质粒进行测序。结果表明,克隆得到的PCV2山东株的全基因组长为1767bp。应用DNAStar序列分析软件,对所测PCV2序列与GenBank中登录的国内外PCV毒株进行同源性比较。结果显示,PCV2山东株与国内外毒株的核苷酸同源性高达99．6％,推导的氨基酸同源性达95．4％。进化树分析结果显示,PCV2山东株与GZ（EF515839）株同源性最高,表明,PCV2各分离毒株在进化方面存在地域上的相关性。 相似文献
11.
本实验用RHDV CD株人工感染家兔,发病死亡后,取肝脏匀浆,用Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒RNA。根据Genbank已发表序列保守区设计并合成引物,采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。PCR产物纯化后,进行序列测定。测序结果表明,VP60主要抗原表位基因长525bp。该序列与已发表的其它13株RHDV VP60同一核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性比较。结果显示,CD株核酸序列与WX-84株同源性最高为97.5%,与其它毒株的同源性在92.0%～96.6%之间。氨基酸序列与WX-84株、墨西哥Mexi-co-89株同源性最高为99.4%,与其它毒株的同源性在96.6%～98.3%之间。 相似文献
12.
RHDVCD株VP60主要抗原表位基因的克隆与序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
本实验用RHDVCD株人工感染家兔,发病死亡后,取肝脏匀浆,用Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒RNA。根据Genbank已发表序列保守区设计并合成引物,采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。PCR产物纯化后,进行序列测定。测序结果表明,VP60主要抗原表位基因长525bp。该序列与已发表的其它13株RHDVVP60同一核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性比较。结果显示,CD株核酸序列与WX-84株同源性最高为97．5％,与其它毒株的同源性在92．0％～96．6％之间。氨基酸序列与WX-84株、墨西哥Mexi—co-89株同源性最高为99．4％,与其它毒株的同源性在96．6％N98-3％之间。 相似文献
13.
在浙江地区进行鸭病病因的调查过程中，从患病鸭群中分离到一株引起鸭产蛋锐减而不死亡的病毒，经鉴定该病毒属于禽副粘病毒Ⅰ型，命名为YH99V株。以YH99V株的基因组RNA为模板，通过RT—PCR一步法扩增出其HN基因的cDNA片段，然后将其克隆至pMD18-T载体中，对其进行序列测定。测序后拼接出HN基因的序列长度为1785bp，该基因的ORF总长为1734bp，编码577个氨基酸。将YH99V株HN基因序列和推导的氨基酸序列与新城疫毒株的HN基因相应序列比较后发现，它们的核苷酸序列同源性分别在82．1％～99．7％，氨基酸序列同源性为87．2％～99．5％。在同源性比较的基础上，进一步绘制了Ⅰ型禽副粘病毒株HN基因的系统发育树。这对于Ⅰ型禽副粘病毒毒力基因的功能分析和该病的分子流行病调查有着重要的意义。 相似文献
14.
采用血凝试验、电镜观察、RT－PCR方法分离鉴定了1株JL株兔出血症病毒（RHDV），扩增衣壳蛋白VP60基因，将扩增片段克隆到pMDl8－T载体上，经酶切鉴定后测序。结果显示，VP60基因全长1740bp，编码580个氨基酸；JL株与其他RHDV分离株比较，核苷酸同源性为93．7％－99．2％，氨基酸同源性在97．3％－99．5％，在VP606个区中，A、B、D、F是稳定区，氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区，表明毒株具有高度保守性；将JL株与国内外标准株蛋白氨基酸变畀及其亲水性、柔性区、抗原区和表面结构进行比较分析，预测RHDV VP60细胞表位。 相似文献
15.
试验旨在分离兔出血症病毒（rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）镇江株,分析其遗传进化变异,并表达具有良好活性的重组VP60蛋白。通过排除细菌感染、血凝（HA）和血凝抑制（HI）检测、动物攻毒试验与病毒传代、LD50测定等方法,自江苏省镇江市某兔场发病死亡动物肝脏组织样品中分离病原并鉴定;RT-PCR方法获得VP60基因,通过分析VP60基因核苷酸及氨基酸序列研究其遗传进化;将VP60基因与pCold-Sumo载体连接,构建低温诱导、融合Sumo标签原核表达载体,15℃、IPTG诱导表达重组VP60蛋白并对表达产物进行反应原性鉴定。结果显示,分离鉴定获得RHDV ZJ2015毒株,该毒株能凝集人"O"型红血球,HA效价为11log2,其血凝性能被RHDV （AV33）抗血清抑制,该毒株的LD50为10-6.38/mL,具有较强的毒力;RT-PCR扩增得到大小约为1 740 bp的特异性条带,系统进化树分析显示,该毒株属于RHDV1抗原遗传变异株（RHDVa）,与RHDV1和RHDV2 VP60基因核苷酸序列同源性分别为89.4%~97.6%和81.1%~81.5%,氨基酸序列同源性分别为93.8%~98.3%和87.4%~87.6%。构建的低温原核融合表达质粒pCold-VP60在大肠杆菌Rosetta （DE3）中成功表达,通过SDS-PAGE及Western blotting分析,在分子质量74 ku处有特异性表达蛋白条带,且与抗血清发生特异性抗原抗体结合反应,说明重组蛋白具有良好的反应原性。本研究为开展兔病毒性出血症流行病学研究、开发新型重组疫苗与诊断试剂提供参考依据。 相似文献
16.
通过对采集到的青岛市某发病羊场羊口疮病料（强毒）在山羊成纤维细胞上连续传90代（弱毒）后, 分别进行病毒基因组提取, 并对提取到的基因组分别命名为ORFV-QD和ORFV-RD。根据GenBank上发表的ORFV全基因组序列设计并合成3对特异性引物, 分别扩增ORFV-QD和ORFV-RD的B2L基因、F1L基因和VIR基因片段, 并将扩增得到的基因组片段分别克隆到pMD-19T载体上, 转化到DH5α感受态细胞中, 对重组质粒进行鉴定后送至测序公司进行测序, 用DNASTAR软件对测序结果进行拼接及3组基因之间核苷酸同源性比较分析, 将测序结果与NCBI上已公布的13组ORFV全基因组相应基因核苷酸序列进行同源性比对分析、构建系统进化树及氨基酸序列比对分析。结果表明, 3组基因与参考序列的B2L基因、F1L基因和VIR基因核苷酸同源性分别为92.1%~98.4%、96.1%~99.1%和94.6%~100%。将2株病毒基因组与参考序列进行氨基酸序列比较分析, 结果显示2株病毒基因组之间并没有较为明显的差异。 相似文献
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为了解江西地区猪圆环病毒2型（PCV-2）的流行和进化情况,根据GenBank上已发表的PCV-2全基因序列设计1对引物,PCR扩增后得到9条PCV-2全基因序列,并对其全基因序列核苷酸和蛋白序列进行分析,绘制遗传进化树。结果表明,江西地区流行的9株PCV-2中,基因组序列全长分为8株1 767 bp和1株1 768 bp,9株PCV-2的核苷酸同源性为94.7%~99.9%,与GenBank己发表的PCV-2分离株全基因组同源性介于94.3%~99.8%之间,而9株PCV-2的ORF1核苷酸序列同源性为96.9%~100.0%。ORF2和ORF3编码的蛋白氨基酸序列存在部分位点突变。遗传进化树显示为3种基因型：5株PCV-2b、3株PCV-2d、1株PCV-2a。本研究有助于江西地区PCV-2的监测和防制。 相似文献
18.
In order to understand the epidemiology and evolution of PCV-2 in Jiangxi province, a pair of primers was designed according to the PCV-2 gene sequence published in GenBank. After PCR amplification, we got the whole genome sequence of 9 strains PCV-2 isolates, and the nucleotide and protein sequences were analyzed, the genetic evolutionary tree was constructed. The results showed that the complete genome of 8 out of the 9 strains were 1 767 bp in length and one strain was 1 768 bp. By analyzing the whole genome sequences of the nucleotide,the homology of nucleotide sequences of the 9 strains was 94.7% to 99.9%.Compared with other whole genome sequences of PCV-2 in GenBank, the homology was 94.3% to 99.8%. The homology of nucleotide sequences of the ORF1 of the 9 strain was 96.9% to 100.0%. ORF2 and ORF3 encoding protein amino acid sequence had some locus mutation. Phylogenetic tree analysis showed that the 9 strains could be divided into 3 genotypes,5 strains belonged to PCV-2b, 3 strains belonged to PCV-2d, and 1 strain belonged to PCV-2a. This study was helpful to monitor and control of PCV-2 in Jiangxi province. 相似文献
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鹅副粘病毒分离株NA-1株经11日龄鸡胚增殖后纯化。提取病毒的基因组RNA，采用RT-PCR扩增出与预期设计的1．7kb大小相符合的特异条带。将扩增产物提纯后克隆入pMD18-T载体，经纯化、筛选及酶切鉴定后，初步获得了含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆，并对阳性克隆进行了测序。测序后拼接得出HN基因的全序列长度为1740bp，该基因的ORF总长为1716bp，编码571个氨基酸。与GenBank下载的15株参考毒株比较HN基因编码区全核苷酸序列，发现所测NA-1株与国内标准强毒株F48E9核苷酸的同源性为84．5％，氨基酸的同源性为89．5％；与传统的疫苗株La Sota核苷酸的同源性为82．2％，氨基酸的同源性为88．5％；与鹅源禽副粘病毒SF02株核苷酸的同源性为97．1％，氨基酸的同源性为97．4％；与鹅源禽副粘病毒YG97株核苷酸的同源性为97．3％，氨基酸的同源性97．4％。说明NA-1株和SF02株、YG97株亲缘关系较近，它们三者可能有着共同的来源。根据基因树分析，NA-1株应属于基因VII型新城疫病毒。由此更进一步证实新城疫可以感染水禽，且对鹅具有高度的致死性。 相似文献