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为建立简便快速检测H7N9亚型流感病毒的方法,根椐GenBank中H7亚型流感病毒的HA基因序列和N9亚型流感病毒的NA基因序列,设计2对特异性引物,在建立H7亚型和N9亚型单项RT-PCR的基础上,优化双重RT-PCR反应条件,建立同时检测H7亚型和N9亚型的双重RT-PCR。对H7N9亚型流感病毒核酸模板进行双重RT-PCR扩增,结果可同时扩增HA基因263bp、NA基因520 bp的特异性片段,而对其他常见亚型的流感病毒的RT-PCR扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,该双重RT-PCR方法的检测下限为3 pg的H7N9病毒模板。利用该双重RT-PCR方法对30份临床样品进行H7N9病毒进行检测,与病毒分离方法进行对比,结果显示,两者的符合率为100%。结果表明建立的双重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、敏感、准确的特点,可用于H7N9流感病毒的同时检测和鉴别诊断,为H7N9亚型流感的有效防控提供技术支撑。 相似文献
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为弄清贵州某野生动物园长臂猿死亡的原因,本试验采用流行病学调查、临床症状观察、病理剖检诊断和RT-PCR检测确诊等方法,对该野生动物园发病长臂猿进行了诊断。试验结果显示,流行病学调查、剖检病理初步诊断该野生动物园长臂猿疑似流感病毒、支原体和细菌混合感染,RT-PCR/PCR检测确诊发病长臂猿为流感病毒、支原体混合感染,细菌分离培养、生化特性鉴定和动物致病性试验确诊为多杀性巴氏杆菌感染。结果表明造成该野生动物园长臂猿发病死亡的原因为流感病毒、支原体和多杀性巴氏杆菌混合感染。根据诊断及药敏试验结果,制定出了免疫预防及治疗措施。 相似文献
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4株不同亚型流感病毒NP基因的原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
为了进一步研究A型流感病毒核蛋白功能及在诊断中的应用,采用RT-PCR技术分别扩增H1N1、H3N2、H5N1、H9N2等4株不同亚型流感病毒的NP基因,分别将其克隆到原核表达载体pET30(a)上,在大肠埃希菌中进行诱导表达.SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,H1N1亚型流感病毒NP蛋白得到表达,并且能分别与H1N1和H5N1亚型流感病毒的鼠高免血清发生特异性反应,具有良好的反应活性;而H3N2、H5N1、H9N2亚型流感病毒的重组NP蛋白未获得表述.本研究结果表明,不同毒株的NP蛋白在大肠埃希菌中的表达具有一定差异性,为把NP蛋白作为诊断抗原的开发、ELISA诊断方法的建立以及蛋白功能的研究奠定了基础. 相似文献
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以H5N1亚型虎源流感病毒免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA试验检测细胞培养上清,获得2株阳性杂交瘤细胞克隆株,命名为3A13和1B8.分别制备腹水后进行纯化,获得了抗H5亚型虎源流感病毒血凝素的单克隆抗体,用制备的单克隆抗体结合胶体金免疫层析技术,制备了H5亚型虎源流感病毒免疫胶体金快速诊断试纸条.该试纸条对H5N1虎源流感病毒鸡胚培养毒、H5亚型禽流感病毒标准抗原,以及24份虎疑似感染H5N1亚型虎源流感病毒感染病料和小鼠模型病料等检测结果为阳性,同时对H7和H9亚型禽流感病毒标准抗原及传染性支气管炎、新城疫抗原等检测结果为阴性;与HA-HI和RT-PCR的平行对比试验表明,试纸条检测敏感度与血凝试验和血凝抑制试验的敏感性相符.本试验所研制的免疫胶体金诊断试纸条可用于H5亚型虎源流感病毒的特异诊断和流行病学调查,为开发成品化检测试纸条奠定基础. 相似文献
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为建立可以区分H7亚型流感病毒强弱毒的方法,根椐Genbank和GISAID中H7病毒的HA基因序列,设计2条特异性引物,建立了扩增H7病毒HA裂解位点区域的通用RT-PCR方法。在此基础上,在裂解位点处设计1条引物,建立了可以区分H7强弱毒的RT-PCR方法。该方法对弱毒株可以扩增出约337 bp的片段,对强毒株可以扩增出约349 bp和227 bp的片段,对其他常见亚型流感病毒的RT-PCR扩增均为阴性。敏感性试验结果表明,该RT-PCR方法的检测下限为1 fg的H7N9病毒模板。该方法对10份实验室已鉴定好的H7N9病毒进行对比验证,两者的符合率为100%。试验结果表明,该方法具有特异、快速、敏感、准确的特点,可用于H7亚型流感病毒的快速检测,同时还可区分强弱毒,对H7N9病毒,尤其是高致病性病毒的早期诊断和有效防控可提供有效技术支撑。 相似文献
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根据GenBank上发表的多株猪流感病毒（SIV）序列,在保守区域设计1对引物,并对RT-PCR反应条件进行优化,建立了可检测出多种亚型猪源流感病毒的RT-PCR方法。通过对反应产物测序分析,与预期结果相符,证明该方法具有很强的特异性;该方法可以检测出约1个TCID50的猪流感病毒,显示较高的敏感性。通过对12份临床样品进行检测,结果发现：该方法和其他两种方法分离病毒符合率相当。本研究建立的猪流感RT-PCR诊断方法具有高特异性和敏感性,适用于SIV的诊断应用和推广。 相似文献
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猪流感病毒H1、H3、N1、N2亚型分型 RT-PCR方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中H1N1和H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(neuraminidase,NA)和M基因保守序列,分别设计合成了5对特异性引物,利用RT-PCR技术对SIV的型和亚型进行鉴定。结果表明,该方法的型RT-PCR可以检测出104 EID50病毒量所提取的RNA;H1、H3、N1和N2的亚型RT-PCR均可以检测出104 EID50病毒量所提取的RNA。除每对特异性引物所对应的亚型外,对其他亚型及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的检测均为阴性,应用该方法对临床样品进行检测,其结果与病毒分离结果符合率为100%。结果表明,该方法特异性好、敏感性高,有望成为SIV的一种特异、敏感、快速的分型检测方法,为猪流感分子流行病学的调查奠定了良好的基础。 相似文献
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猪流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：1，他引：1
本研究选取猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的NP基因序列设计引物和探针,建立了检测SIV的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有SIV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。2.0×108至2.0×102拷贝/μL 7个数量级的范围内定量PCR有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为20个拷贝/μL。根据病毒拷贝数与Ct值的关系绘制了标准曲线。该方法具有特异性,对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸都没有扩增反应。本研究建立的实时定量PCR方法,灵敏度高、特异性好,可以进行定量分析,在猪流感的快速检测上具有重要意义。 相似文献
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根据GenBank已公布的狂犬病病毒(rabies virus,RV)核蛋白(N)基因序列设计并合成一对特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针的荧光RT-PCR检测狂犬病病毒方法。对狂犬病疫苗提取核酸后进行RT-PCR扩增,将目的条带切胶回收,克隆测序,重组质粒作为标准阳性对照。对建立的TaqMan探针荧光RT-PCR方法做灵敏度、特异性、重复性及稳定性试验。结果显示,该方法可以达到10拷贝/μL的灵敏度,可以将狂犬病病毒与犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒和犬副流感病毒分开,方法重复性好,稳定可靠。 相似文献
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禽流感病毒几种RT-PCR诊断技术 总被引：8，自引：2，他引：6
目前常采用琼脂扩散或间接 EL ISA监测禽流感的抗体水平 ,而针对抗原的检测一般采用病毒分离鉴定 ,这种方法需要的时间较长 ,不能对高致病禽流感做出迅速判定 ,因此 ,生产实践中迫切需要新的快速诊断方法。 RT-PCR就是一个很有开发、推广前景的快速诊断技术 ,特别是随着整个行业技术水平的提高 ,RT-PCR逐渐成为一种常规方法 ,可以应用于病原核酸的检测和亚型的鉴别 ,在禽流感病毒的快速诊断中越来越受到重视。依据其原理和技术特点的差异 ,RT-PCR技术又分为常规、巢式、荧光、多元 PCR和 PCR-RFL P、RRT-PCR等。本文对这些 RT-PCR技术在禽流感诊断中的应用做了简要论述。 相似文献
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根据Ⅶ型新城疫病毒基质蛋白基因保守序列设计并合成特异性引物,建立快速检测Ⅶ型新城疫病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。通过RT-PCR方法克隆Ⅶ型新城疫病毒M基因靶序列,并将其连入T-Easy载体,制备阳性标准品,优化反应条件,以10倍系列稀释的标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.999。检测结果显示,该方法的灵敏度可达100 copies/μL,而且特异性良好,除Ⅶ型新城疫病毒外,对Ⅱ型/Ⅲ型/IV型/Ⅸ型新城疫病毒、H5亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒检测结果均为阴性。本研究所建立的检测方法重复性好,批内和批间变异系数均小于5%。对40份实验感染样品的检测结果表明,其检出率为95%,而常规RT-PCR方法检出率仅为70%,表明该方法比常规RT-PCR检测方法灵敏度更高、特异性更强。 相似文献
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鸭黄病毒感染逆转录半套式PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank发布的黄病毒Bagaza毒株的NS3基因的保守序列设计了3条引物,建立了一种适用于鸭黄病毒的半套式PCR快速检测方法。采用该方法对鸭黄病毒山东分离株进行检测,结果半套式PCR对2株分离株均能扩增出277bp的特异性条带,而对鸭瘟病毒、禽流感病毒（H9亚型）、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒的扩增结果均为阴性;经检测该方法第1次扩增的敏感性为1×105拷贝/μL,第2次扩增的敏感性为1×102拷贝/μL,第2次扩增的敏感性比第1次高103倍;该方法对山东省各地采集的24份疑似病料可检出22份阳性。表明本试验所建立的套式PCR方法可用于鸭黄病毒感染的临床诊断和流行病学调查。 相似文献
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H5、H9亚型禽流感病毒快速鉴别诊断方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为了快速、敏感、特异地鉴别诊断我国目前流行的禽流感，根据H5、H9亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计并合成2对特异性引物，利用这2对引物对H5、H9亚型禽流感病毒的HA基因片段进行二联RT—PCR扩增，并对二联RT—PCR检测方法进行了敏感性及特异性试验。结果表明，这2对引物能特异地扩增H5、H9亚型禽流感病毒HA基因片段，大小分别为490bp和686bp；该检测方法敏感性高，特异性强；初步建立起快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H9亚型禽流感病毒的分子诊断方法。 相似文献