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1.
为检测熊源粪肠球菌心内膜炎抗原（EfaA）基因,用于快速检测东北黑熊粪肠球菌感染病例,本试验根据GenBank登录的粪肠球菌EfaA基因序列（登录号：U03756.1）合成了1对PCR引物,通过PCR法扩增合成长度为689 bp的目的片段。将PCR产物克隆于pMD19-T载体,之后将其转入大肠杆菌DH5α感受态细胞筛选阳性克隆。提取扩增后的重组质粒pMD19-T-EfaA并进行PCR、酶切鉴定、序列测定及蛋白质结构预测。结果显示,本试验成功克隆出熊源粪肠球菌EfaA基因,与GenBank登录的ATCC 29212菌株同源性为100.0%。本试验成功构建了重组克隆载体pMD19-T-EfaA,并对测序结果进行了蛋白质结构的预测,为进一步建立黑熊粪肠球菌病的诊断方法提供了理论依据,同时也为黑熊疾病的防制奠定了基础。 相似文献
2.
试验旨在构建EfaA基因的原核表达质粒,并对其进行表达。根据GenBank中粪肠球菌EfaA基因序列（登录号：U03756）设计合成1对引物,利用PCR法扩增、克隆EfaA基因,并进行生物信息学分析,将EfaA基因亚克隆于pGEX-4T-1原核表达载体,构建pGEX-4T-EfaA原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,用IPTG诱导表达,筛选最佳诱导时间并分析其表达蛋白的生物学特征。结果发现,试验成功获得大小为873 bp的粪肠球菌EfaA基因。经IPTG诱导后,获得分子质量约为59 ku的EfaA重组蛋白,以37℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6 h表达量最大。经Western blotting分析发现,具有较好的反应原性。本试验成功构建原核表达质粒pGEX-4T-EfaA,并在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中成功表达。 相似文献
3.
为构建烟台黑猪SLA-2-YTH基因原核表达载体,本研究设计引物PCR扩增SLA-2-YTH胞外区,将其克隆至pMD 19-T Simple 载体,筛选阳性克隆。阳性克隆经酶切后,进一步与表达载体pET-28a(+)连接,转化BL21（Rosseta）感受态细胞并进行诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况。结果显示,SLA-2-YTH胞外区亚克隆大小为834 bp,酶切鉴定证实其成功插入pET-28a（+）表达载体。SDS-PAGE结果显示,SLA-2-YTH基因导入宿主菌后成功表达,蛋白大小约31.0 ku,与预期结果相符,优化后蛋白相对表达量达25%以上。本研究成功构建了烟台黑猪SLA-2-YTH原核表达载体,获得了表达蛋白,为今后进一步的结构和功能研究奠定基础。 相似文献
4.
牛GM-CSF与金黄色葡萄球菌黏附素FnBPB共表达质粒的构建与原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
采用PCR方法对牛粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和金黄色葡萄球菌FnBPB的D区进行特异性的扩增,并通过重叠延伸PCR扩增GM-CSF-FnBPB串联基因,构建了克隆质粒pMD19-GM-CSF-FnBPB。利用表达载体pET-32a(+)对该融合基因片段进行原核表达,SDS-PAGE分析表明,在1mmol/L IPTG诱导浓度下,在39ku处出现了与目的蛋白一致的外源蛋白带,Western blot分析表明,该蛋白具有反应原性,进而证明该融合基因成功在原核细胞中表达。 相似文献
5.
为构建猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒,试验根据GenBank中登录的猪附红细胞体ENO基因序列（登录号：CP002525.1）设计特异性引物,对ENO基因进行PCR扩增,并将纯化后的PCR产物克隆到pMD19-T载体中。用Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ对pMD19T-ENO进行双酶切后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体PCR259中,构建PCR259-ENO重组质粒,提取重组质粒进行鉴定。应用脂质体介导转染法将鉴定正确的PCR259-ENO重组穿梭质粒转染293细胞,应用间接免疫荧光法（IFTA）检测ENO基因在293细胞中的表达。结果显示,试验克隆的ENO基因长为1 182 bp,编码393个氨基酸,与GenBank中ENO基因序列（登录号：CP002525.1）同源性为99%。构建的重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO经PCR和酶切鉴定正确,并且能在293细胞中表达,表明ENO基因成功插入腺病毒穿梭质粒PCR259中,重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO构建成功。 相似文献
6.
为研究斯氏副柔线虫(Parabronema skrjabini)种间遗传标记特点,从内蒙古地区骆驼皱胃中采集斯氏副柔线虫成虫,提取虫体DNA,利用线虫通用引物扩增细胞色素氧化酶1(CO1)基因,将其克隆到pMD19-T载体后,用PCR技术鉴定阳性菌落并进行测序,运用DNAStar 5.0和MEGA 4.0软件将测序结果与GenBank公布的相关线虫CO1序列进行比对分析。结果显示:斯氏副柔线虫DNA扩增出的CO1基因序列片段长度为689 bp。同其他相关属线虫CO1基因序列比对,斯氏副柔线虫与小口柔线虫(Habronema microstoma)、蝇柔线虫(Habronema muscae)的同源性最高,为86.7%,遗传距离为0.143;与加利西亚光丝虫(Litomosoides galizai)的同源性最低,为80.1%,遗传距离为0.229。通过两种不同方法建立的系统发育树比较,证实斯氏副柔线虫与柔线属线虫均位于同一分支,自展值都在47%以上。表明CO1基因不仅可以作为斯氏副柔线虫理想的种间遗传标记,也可为该线虫进一步的分子分类学研究提供重要基础。 相似文献
7.
采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒（TGEV）SC-H株S基因N端主要抗原位点片段（大小约为1 916bp）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）SC-L株S1基因（大小约为2 367bp）,插入pMDl9-T simple载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒pMD19-T-TS与pMD19-T-PS1。从T载体上将PS1、TS基因切下,以亚克隆方法插入双启动子真核表达载体pVAXD,构建能同时表达TGEV S基因和PEDV S1基因的重组质粒pVAXD-PS1-TS。对重组质粒进行PCR与酶切鉴定后,以脂质体转染法转染COS7细胞,间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达情况。结果表明,重组质粒构建正确且能够在COS7细胞中得到表达,转染的细胞呈现特异性荧光。真核表达质粒pVAXD-PS1-TS的成功构建为进一步研究PEDV和TGEV的二联核酸疫苗奠定了基础。 相似文献
8.
参照猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)血清1型菌株,设计1对特异性引物,PCR扩增转铁结合蛋白B(tbpB)全基因,克隆到pMD19-T Simple载体中,经测序比较,与参考序列的核苷酸同源性达99.72%。试验将tbpB基因定向克隆到pET-32a( )中,转化BL21(DE3),经诱导后,SDS-PAGE结果显示转铁结合蛋白B得到表达,Western blot检测呈阳性。 相似文献
9.
参照GenBank公布的仅有的日本株猪细胞巨化病毒较大衣壳蛋白（MCP）基因序列（登录号：AB051069）设计2对引物,采用分步克隆的方法,将PCMVMCP全序列克隆入pMD19-T载体进行测序,成功获得了pMD-MCP重组质粒,将所得序列录入到GenBank中（登录号：HQ025802）。测序结果表明,该MCP基因全长4017bp,共编码1338个氨基酸;与NCBI上公布的仅有的日本毒株MCP基因的核苷酸同源性为96．8％,氨基酸同源性为94．1％;进化分析显示：PCMVMCP基因与人疱疹病毒6型或7型的MCP基因亲缘关系较近;利用生物信息学软件对蛋白质结构特征进行分析,发现该蛋白含有59个潜在的磷酸化位点,潜在功能强大;亚细胞定位预测结果表明该蛋白主要存在于线粒体中和细胞质中并各占39．1％和26．1％,内质网占17．4％,高尔基体占8．7％,空泡和细胞核均占4．3％,表明PCMVMCP蛋白属于胞质蛋白,抗原区位集中于胞膜,有向胞质移动的趋势;另该成熟蛋白存在18个主要的抗原位点,将肽链经亲水性与抗原表位的共同分析,发现其肽链的c端极有可能分布有抗原决定簇。 相似文献
10.
中国2个地方品系猪SLA-3原核表达载体构建及表达 总被引：2，自引：1，他引：1
为构建中国地方品系荷包猪及莱芜黑猪SLA-3(命名为SLA-3-HB和SLA-3-LW)原核表达载体及表达目的蛋白,试验通过PCR扩增获得SLA-3胞外区基因,并克隆至pMD19-T Simple载体,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,酶切及测序筛选阳性重组质粒;重组质粒经酶切回收,目的片段进一步连接pET-21a(+)表达载体,并转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导目的基因的表达;SDS-PAGE检测目的蛋白。结果显示,PCR成功扩增SLA-3-HB及SLA-3-LW胞外区,大小约850 bp,目的基因成功克隆至pMD19-T Simple载体,并筛选序列正确的阳性重组质粒。进一步研究证实,SLA-3-HB及SLA-3-LW成功连接到表达载体pET-21a(+),插入片段长度均为831 bp。经诱导后,SLA-3-HB及SLA-3-LW均成功表达,表达蛋白大小为31 ku,相对表达含量达到40%。本研究成功构建了中国地方品系荷包猪及莱芜黑猪SLA-3原核表达载体,为进一步研究其结构和功能奠定基础。 相似文献
11.
应用重叠扩增PCR(SOE PCR)技术将鸡白细胞介素15(ChIL-15)的冗长信号肽序列替换为较短的鸡白细胞介素2(ChIL-2)信号肽序列,构建了一种新型ChIL-15融合基因(NChIL-15).将其连接到克隆载体pMD18-T中得到重组克隆质粒pMD18T-NChIL-15.阳性克隆质粒经鉴定正确后将NChIL-15基因亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,得到重组阳性表达质粒pcDNA3.1(+)-NChIL- 15.阳性表达质粒经鉴定正确后应用磷酸钙法体外转染293T细胞,通过间接免疫荧光试验(IFA)检测到了NChIL-15蛋白在293T细胞中的表达.本研究为NChIL-15佐剂作用的深入研究奠定了基础. 相似文献
12.
试验旨在对单增李斯特菌新疆绵羊脑炎临床分离株LM90SB2的lmo2192基因进行克隆及生物信息学分析。根据GenBank中lmo2192基因序列（登录号：CAD00270）设计特异性引物,利用PCR方法对lmo2192基因进行扩增,回收目的基因,连接到pMD19-T载体上进行克隆,筛选阳性菌进行测序,测序后对lmo2192基因核苷酸序列进行分析,预测其编码蛋白质的二级结构、三级结构,对其进行同源性比对及遗传变异分析。结果显示,新疆分离株LM90SB2的lmo2192基因序列全长为1 277 bp,包含969 bp开放阅读框,共编码322个氨基酸;LM90SB2株lmo2192基因核苷酸序列与CⅡMS-PH-1同源性为100.0%,与81-0861、10-0809、81-0592、81-0558、NTSN、F2365和WSLC1033的同源性为99.8%~99.9%,与L2074和NH1同源性分别为97.0%和96.9%。推导的氨基酸序列同源性为91.6%~100.0%。系统进化树显示,LM90SB2菌株lmo2192基因与4b血清型菌株亲缘关系较近,聚为同一分支。蛋白质二级结构预测表明,LM90SB2 lmo2192蛋白为亲水性蛋白,无信号肽,不形成跨膜结构。蛋白结构域预测,lmo2192蛋白为ATP酶组分。本试验成功克隆LM90SB2分离株lmo2192基因,为进一步研究其基因功能提供理论依据。 相似文献
13.
鸡传染性支气管炎病毒分离株核衣壳基因克隆、序列分析和真核表达 总被引：2，自引：0，他引：2
根据GenBank公开序列自行设计一对引物，采用RT—PCR扩增出鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）W和C9001分离株完整的核衣壳（N）基因，并将其克隆至pMD18-T载体进行核苷酸序列测定和分析。结果表明，扩增的2个IBV分离株核衣壳基因片段长度均为1230bp，编码409个氨基酸，彼此间核苷酸和氨基酸同源性分别为88．0％和89．5％，与GenBank中有代表性的参考毒株相应基因核苷酸和氨基酸序列比较显示，w株核苷酸序列与GenBank中的广东分离株（AY646283）同源性最高，为94．1％，氨基酸序列同源性为94．6％；与国内部分毒株核苷酸序列同源性在86．1％～88．0％之间，氨基酸序列同源性在88．0％～90．7％之间；C9001株与国内部分毒株核苷酸序列同源性在86．4％～99．8％之间，氨基酸序列同源性在88．0％～99．8％之间。从核衣壳基因编码的氨基酸序列的系统进化树可见，W株与C9001株处于不同的进化分枝，亲缘关系较远。同时将核衣壳基因构建于真核表达质粒pVAX1中，用脂质体法将重组质粒转染入COS-7细胞中，间接免疫荧光检测出核衣壳蛋白的体外表达。研究结果为进一步研究IBV核衣壳蛋白的结构与功能以及基因工程疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
14.
The swine leukocyte antigen (SLA) genes in pigs were the important immune gene group in antigen presentation, and studing on SLA could provide the references for the prevention of some infectious diseases. Earlier studies found that SLA-1-632-TPK gene in ToPigs pig had a deleted base in its coding sequence (a single base "C" was lost in 632 bp from the 5' end of the SLA-1-632-TPK gene), which lead to frameshift mutation. In order to correct the SLA-1-632-TPK gene, two pairs of gene-correction's primers were designed to correct the gene by the splicing overlap extension PCR (SOE-PCR) in template of recombinant plasmid of SLA-1-632-TPK/pMD18-T. Firstly,the 5'and 3'ends of SLA-1-632-TPK gene were amplified, respectively, then both of them were spliced and amplified to form an intact SLA-1-632-TPK gene. After detected by agarose electrophoresis, the interest of the product was further cloned into pMD19-T Simple vector. The positive clones were screened by colony PCR and then sequenced. The result showed that the 5'and 3' ends of the SLA-1-632-TPK gene were all amplified successfully by SOE-PCR, with the products of about 650 and 590 bp, which were consistent with the theoretical value of 648 and 585 bp, respectively. After spliced, the intact sequence of SLA-1-632-TPK gene was obtained with the product of about 1 200 bp, which was close to the theoretical value of 1 223 bp. The colony PCR result showed that the corrected gene was successfully inserted into pMD19-T Simple vector . After the sequence was analyzed by GENETYX version 9.0, it was shown that the nucleotide "C" in 632 bp numbered from the 5'end of the gene was added and the SLA-1-632-TPK gene was coded correctly. In this study, the SLA-1-632-TPK was corrected successfully, and the recombinant plasmid SLA-1-TPK/pMD19-T was constructed, which would lay a foundation to further study the protein expression and associated function of SLA-1-TPK. 相似文献
15.
猪白细胞抗原（swine leukocyte antigen,SLA）在猪免疫系统中起递呈抗原作用,对其展开研究可为猪相关传染病的预防提供依据。研究发现,托佩克猪SLA-1-632-TPK基因编码序列发生碱基缺失（距离SLA-1-632-TPK基因5'端632 bp处丢失1个碱基"C"）,导致移码突变。为矫正SLA-1-632-TPK基因,设计2对矫正引物,以原重组质粒SLA-1-632-TPK/pMD18-T为模板,利用剪切重叠延伸PCR（splicing overlap extention PCR,SOE-PCR）技术分别扩增SLA-1-632-TPK 5'和3'端,之后进行拼接,最后扩增全序列从而矫正目的基因,并进一步连接pMD19-T Simple载体,通过单菌落PCR筛选阳性克隆并测序,并通过GENETYX version 9.0软件对所测序列进行分析。结果显示,SOE-PCR成功扩增得到5'和3'端片段,大小约为650和590 bp,与理论设计值大小（648和585 bp）接近,经过拼接以后,得到全长约1 200 bp,与理论设计值1 223 bp接近。菌落PCR结果显示,矫正基因成功克隆入pMD19-T Simple载体。序列分析结果显示,托佩克猪SLA-1-632-TPK基因距离5'端632 bp处丢失的碱基"C"得到矫正并正确编码。本研究成功矫正了SLA-1-632-TPK基因,并构建其重组质粒SLA-1-TPK/pMD19-T,为下一步研究SLA-1-TPK蛋白表达和相关功能奠定基础。 相似文献
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内源性绵羊肺腺瘤病毒NM株gag基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测 总被引：2，自引：0，他引：2
提取内源性绵羊肺腺瘤病毒内蒙古分离株（NM）总DNA，参照GenBank中内源性绵羊肺腺瘤病毒enJS56A1株gag基因序列设计1对引物。应用PCR技术特异性地扩增出病毒的gag基因片段，将其克隆到pMD19-T载体中进行测序得到完整的gag基因序列，并用DNAStar软件进行序列分析，分析结果表明，与内源性南非代表毒株enJS56A1（AF153615）的gag基因序列比较，核苷酸同源性为98．9％，推导出的氨基酸同源性为98．4％。与外源性美国代表株JSRV21（AF105220）的gag基因序列比较，核苷酸同源性为89．6％，氨基酸同源性为94．8％。利用生物信息学软件对其蛋白结构进行预测，结果表明gag-enJSRV-NM为一结构松散的蛋白分子，这也是我国首次报道的内源性绵羊肺腺瘤病毒的gag基因的全序列，为我国科研工作者进行更深入的研究奠定了基础。 相似文献
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为了构建荷包猪SLA-3-HB01基因四聚体前体链原核表达载体,并获得SLA-3-HB01表达蛋白,试验以SLA-3-HB01/pMD18-T为模板进行PCR扩增四聚体前体链SLA-3-HB01-BSP,并克隆至pMD19-T载体中,经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切筛选阳性克隆并测序,目的基因连接至表达载体pET-21a（+）,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白大小及表达情况,提取包涵体并进行检测。结果显示,PCR成功扩增得到SLA-3-HB01-BSP,大小为896 bp左右。酶切鉴定证实,目的基因成功克隆至pMD19-T载体中,插入片段大小为876 bp,阳性克隆经测序后所获序列与原序列一致,并在3'端带有BSP标签序列。酶切鉴定进一步证实成功构建SLA-3-HB01-BSP/pET-21a（+）重组表达载体,经转化及诱导表达,SDS-PAGE检测显示目的蛋白分子质量在33.5 ku左右。包涵体蛋白分子质量约33.5 ku,与菌体中目的蛋白大小一致,经凝胶成像系统UVP扫描分析,包涵体蛋白纯度接近于90%,符合进行相关结构和功能研究的要求。本研究成功构建了荷包猪SLA-3-HB01基因四聚体前体链的pET-21a（+）重组表达系统,并获得了一定纯度的包涵体蛋白。 相似文献
19.
本试验旨在表达并纯化鞭毛蛋白,为研究并获得高效蛋白佐剂奠定基础。用PCR扩增鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因fljB、fljB’和fliC,将扩增产物克隆至pMD19-T Simple Vector上,构建了克隆质粒pMD19-fljB、pMD19-fljB’和pMD19-fliC。克隆质粒经双酶切后将片段克隆至pET-30a中,构建原核表达质粒pET30a-fljB、pET30a-fljB’fliC和pET30a-fliC。经PCR、酶切及测序鉴定后将阳性表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导表达后的菌体经超声处理取上清,用Ni柱进行纯化。Western blotting证实了表达的蛋白能与豚鼠抗鞭毛蛋白血清发生特异性反应。通过优化表达条件,鞭毛蛋白fljB、fliC和fljB’fliC均以可溶性表达,纯化得到的鞭毛蛋白为后续评价其佐剂效应奠定基础。 相似文献
20.
水牛抑制素α亚基基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR方法从水牛卵巢总RNA中扩增抑制素α亚基基因,并克隆入pMD18-T载体,进行PCR、双酶切及测序鉴定.序列分析结果表明:水牛抑制素α亚基基因编码序列长为1 083 bp,编码360个氨基酸,与牛、人、猪抑制素α亚基基因CDS成熟蛋白氨基酸的同源性分别为96%、80%、87%,表明抑制素α亚基是一组在进化上高度保守的蛋白质.将水牛抑制素α亚基基因CDS克隆到pET-30a表达载体中,转化宿主菌BL21(DE3)进行原核表达.在1 mmol/L IPTG 中,37 ℃诱导表达4 h后抑制素α亚基基因重组蛋白可成功获得表达.将表达产物进行SDS-PAGE分析,结果表达产物主要以包涵体形式存在,分子质量约为40 ku. 相似文献