猪传染性胸膜肺炎快速PCR诊断   总被引：4，自引：2，他引：4  

彭小华  何孔旺  陆承平 《中国兽医学报》2005,25(6):591-593

根据GenBank中猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropeumoniae，App）外膜蛋白（oml）基因序列，设计合成1对特异性引物，进行PCR检测。时App1、2、3、4、5a、5b、6、7、9型参考株均扩增出大小为1010bp左右的片段，而时马链球菌兽疫亚种、多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、产肠毒素大肠杆菌等均未扩增出任何条带。用相应的限制性内切酶分别酶切PCR扩增产物，均得到与预期一致的结果；PCR检测的敏感度迭10CFU。将建立的PCR方法初步应用于6头人工发病猪的鼻拭子和痛死猪的肺组织．均得到较好的检测结果．  相似文献   

猪源肠毒素性大肠杆菌菌毛基因多重PCR检测方法的建立     

华荣虹  张书霞  何孔旺 《中国兽医学报》2006,26(2):162-164

为了对猪源产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）的4种主要菌毛（K88、K99、F41和987p）进行快速检测和分型，建立了检测4种菌毛的多重PCR方法。首先设计合成4对4种菌毛特异性的引物，然后用4种菌毛参考ETEC菌株优化了多重PCR方法。该方法对K88、K99、F41和987p 4种菌毛的扩增产物分别为201，314，380和459bp。对4种扩增产物分别进行酶切鉴定，结果均得到与预期一致的2个片段。对各个参考菌株不同组合的检测结果为100％符合。结果表明，该多重PCR方法具有很好的特异性和敏感性，可用于ETEC性腹泻的辅助诊断及ETEC菌毛抗原分型检测。  相似文献   

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素I基因的克隆、序列分析及表达     

王芳  何孔旺  邱索平  彭小华  倪艳秀  张雪寒  郭容利  俞正玉 《中国预防兽医学报》2006,(2)

参照猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型Ⅰ菌株序列设计了一对特异性引物,用PCR方法扩增毒素Ⅰ基因,得到约920bp的片段,与参考序列的核苷酸同源性达99.3%,定向克隆到pET32a(+)中,转化BL21(DE3)经诱导后毒素Ⅰ基因得到高效表达Westernblot鉴定呈阳性  相似文献   

仔猪大肠杆菌病K88-K99-987P-F41四价亚单位疫苗的研制Ⅳ.疫苗生产与免疫效力试验     

袁万哲  何孔旺  陆承平 《中国兽医学报》2007,27(6):818-820,861

选用4株带有K88、K99、987P、F41粘附素抗原的产肠毒素性大肠杆菌,分别接种于BBL、Minca、Slanetz和Minca培养基进行培养,将培养物加热提取粘附素抗原后,加入油佐剂制成四价亚单位疫苗。经成品检验合格后分别免疫小鼠和怀孕母猪,同时监测怀孕母猪抗体。最后1次免疫后15 d,分别用同源ETEC确定的攻毒剂量攻击。结果显示,经2次免疫后,K88、K99、987P、F41对小鼠的免疫保护率与1次免疫没有显著差异(P>0.05);对仔猪,1次免疫跟2次免疫均可显著地降低腹泻指数(P<0.05),2次免疫与1次免疫没有显著差异(P>0.05)。怀孕母猪免疫1周后(产前23 d)抗体开始上升,第2周(产前16 d)达到高峰。2次免疫后抗体迅速回升,第4周(产前2 d)达到最高峰,产后2 d抗体大幅度下跌,几近免疫前水平。二免母猪所产仔猪发病率明显低于一免母猪(P<0.05)。攻毒保护试验和抗体消长规律的结果表明,制备的仔猪大肠杆菌病K88-K99-987P-F41四价亚单位疫苗具有良好的免疫原性,能有效预防仔猪大肠杆菌病的发生。  相似文献   

猪Hokovirus TaqMan荧光定量PCR方法的建立与应用     

李彬  杜露平  何孔旺  刘浩飞  温立斌  张雪寒  郭容利  茅爱华  倪艳秀 《中国预防兽医学报》2013,35(6)

为建立检测PHoV的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究根据PHoV的VP2基因序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有VP2基因的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应.结果显示,该方法的检测灵敏度为10拷贝;而且该检测方法特异性较好,与猪的其他病毒核酸均无交叉反应;批内和批间的变异系数低于3.29％,表明该方法的重复性较好.对华东地区采集的225份临床样品进行检测,结果显示,PHoV的阳性率为14.2％.本研究建立的荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,可以为PHoV的流行病学调查和发病机制等研究提供可靠的工具.  相似文献   

次黄嘌呤核苷酸脱氢酶对猪链球菌2型GN061215生物学特性及蛋白质表达的影响     

周俊明  何孔旺  倪艳秀  张雪寒  杨志彪  祝昊丹  温立斌  俞正玉  茅爱华  吕立新 《江苏农业学报》2013,(1):114-120

为了了解次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)对猪链球菌2型GN061215致病力的影响机制,利用同源重组技术,敲除猪链球菌2型GN061215的impdh基因,重组后的GN061215命名为GN061215(△IMPDH),比较GN061215与GN061215(△IMPDH)培养特性、生化特性、致病力以及基因转录水平差异。结果显示impdh基因敲除后,引起GN061215生长曲线迟缓期延长,降低了GN061215生长曲线平台期OD600峰值,同时截短了GN061215菌株成链长度;GN061215、GN061215(△IMPDH)对46种代谢底物利用能力一致,对2种代谢底物利用存在差异;GN061215(△IMPDH)对Balb/c小鼠的致病力较GN061215菌株有一定程度的下降。SDS-PAGE显示GN061215(△IMPDH)菌体的粗提蛋白质条带较GN061215有显著减少;基因芯片比较GN061215、GN061215(△IMPDH)基因转录差异发现,下调基因中存在36个关联核糖体大、小亚基合成的基因,而在上调基因中不存在该类基因,表明impdh基因的丢失影响了GN061215菌株核糖体大、小亚基的合成,进而显著减少了GN061215菌株菌体蛋白质的表达,这可能与GN061215菌株毒力的下降有关。  相似文献   

猪传染性胃肠炎与流行性腹泻     

何孔旺 《农家参谋》2004,(12):30

猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎是猪腹泻中最为重要的两种病毒性腹泻症。在我国流行十分广泛,全国各地均有发生与流行,每年冬春季节在猪群中流行。流行特点病猪及带毒猪是主要的传染源,病毒随粪便、乳汁、呕吐物、鼻分泌物、呼出的气体排出,污染饲料、饮水、空气、土壤、用具等,  相似文献   

猪圆环病毒2型间接ELISA检测方法的建立     

潘群兴  何孔旺  段治涛  黄克和 《江苏农业学报》2007,23(6):588-592

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列设计特异性引物,进行PCR反应,回收PCR产物,将其克隆入pMD18-T载体,再定向克隆到表达载体pET-32a中并转化大肠杆菌Rosetta,进行原核表达.表达产物经His-Bind蛋白纯化试剂盒纯化,平均浓度为1.10 mg/ml.以1.8 μg/ml蛋白包被酶标板,建立ELISA检测方法.建立的ELISA方法与北京世纪元亨公司试剂盒比较,两者检测结果符合率达85%以上.用该方法对常州某猪场36份母猪和156份10～160日龄猪群血清样品进行了检测,检测结果显示母猪阳性率为81.4%,仔猪阳性率随着日龄的增加而逐渐降低,之后由于受PCV-2的感染,阳性率逐渐升高.本试验建立的ELISA方法,具有较好的特异性、重复性和敏感性,可用于猪群PCV-2抗体的大规模检测.  相似文献   

2种猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及比较     

周忠涛  王小敏  汪伟  茅爱华  温立斌  倪艳秀  何孔旺 《农业科学与技术》2015,(1)

[目的]实现在体外对猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）的定量检测。[方法]设计合成2组特异性引物和 TaqMan探针,构建分别包含 PCV2 ORF1和 ORF2基因全长的重组质粒作为标准品,经过反应体系和反应条件的优化,绘制标准曲线,建立2种检测PCV2的分别基于 PCV2 ORF1和 ORF2的TaqMan荧光定量PCR方法。[结果]所建立的2条标准曲线的 Ct值与模板拷贝数的对数之间具有良好的线性关系,相关系数 R均在0.99以上,扩增效率均在90%~110%;重复性好,组内变异系数均小于5%;特异性强,以猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）为模板时均无扩增;敏感性高,ORF1方法可达1.0×101 copies/μl,ORF2方法可达1.0×102 copies/μl。用建立的2种荧光定量PCR方法分别对80份临床样品进行检测并对结果进行比较,结果表明,其中72份临床样品的定量结果数量级基本一致,有8份临床样品的定量结果数量级不一致。利用 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法对8份样品进行了检测,证明这8份样品中确实存在 P1的感染。[结论]基于ORF1建立的定量检测方法更为准确,可用于PCV2的快速诊断和定量检测。  相似文献   

猪链球菌病疫苗研究进展     

何孔旺  周俊明 《动物保健》2009,(8):22-23

猪链球菌病是由多种猪源链球菌所引起的猪的多种病症的总称。其病原包括C群马链球菌兽疫亚种（简称C群菌）、猪链球菌（主要有致病性较强的猪链球菌2型（简称SS2）、猪链球菌9型（简称SS9））以及D群和E群链球菌等。临床表现为急性死亡、急性败血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎、多发性浆膜炎、肺炎、母猪流产以及化脓性淋巴结炎、颊部或颈部脓肿等。近年来,猪链球菌病在我国呈现不断上升的趋势,不仅可以直接致病,而且是猪病混合感染和（或）继发感染的常见病原,  相似文献