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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是危害养猪业发展的重要传染病之一。2006年我国首次爆发高致病性PRRS(highly-pathogenicPRRS,HP-PRRS),与经典的PRRS相比,HP-PRRS发病率和死亡率均显著升高。目前,对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly-pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)引起的高发病率和高死亡率的机制仍不清楚。本研究利用1MOI的EGFP标记的HP-PRRSV毒株HuN4(rHuN4-EGFP)和其体外传代致弱毒株HuN4-F112(rHuN4-F112-EGFP)分别感染肺泡巨噬细胞(pulmonaryalveolarmacrophage,PAM),24h后通过流式细胞术,从FITC通道收集被PRRSV强弱毒感染的PAM,提取膜蛋白进行Shotgun质谱分析。试验最终获得82个在强弱毒感染PAM过程中存在差异表达的膜蛋白。感染rHuN4-EGFP的样品与未感染样品相比,有72个蛋白特异表达;感染rHuN4-F112-EGFP的样品与未感染样品相比,有12个蛋白特异表达。通过GO分析发现,这些蛋白主要参与代谢、生物调节与细胞加工过程,大多数蛋白具有结合、催化活性。进一步在MARC-145细胞上过表达部分差异膜蛋白,发现其中前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9(proprotein coverteases subtilism/kexin 9,PCSK9)能明显抑制PRRSV强毒株和弱毒株的复制,Clusterin、Apoliprotein C-II能促进PRRSV强毒株复制。本研究表明利用Shotgun质谱技术鉴定出的差异表达膜蛋白对PRRSV复制有影响,深入分析PRRSV感染后差异表达的膜蛋白变化将有利于进一步明确其致病机制。 相似文献
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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株主要囊膜糖蛋白GP5的遗传变异分析 总被引：5，自引：0，他引：5
为了探究高致病性猪蓝耳病病毒（HP-PRRSV）的遗传变异特征,本研究对GenBank中235株HP—PRRSV GP5序列的遗传进化、主要氨基酸基序、抗原性以及N-糖基化位点数量和位置的变异进行了分析。结果表明HP-PRRSV之间的同源性较高,与其他参考毒株相比,这些病毒处于一个相对独立的分支中,而且与经典疫苗株的亲缘关系较远。这有助于解释经典疫苗株对于HP—PRRSV为何起不到理想的免疫保护效果。在病毒的中和表位序列中存在着规律的点突变,同时抗原性比较显示HP-PRRSV与经典毒株之间存在着一定的差异。绝大多数的HP-PRRSV的N-糖基化位点在数量上多一个,而且位置要向羧基端平移2个氨基酸,从而使得中和表位两侧直接与糖链相连,可能会造成中和表位被糖侧链所遮掩,本研究由此推测减弱中和抗体对HP-PRRSV的有效识别,促进病毒逃避机体体液免疫。 相似文献
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为探究猪流行性腹泻病毒(PEDV)的新毒株SHpd/2012在感染细胞时与细胞的相互作用机制,根据已得到的序列设计引物,克隆了S1和S2基因片段,构建了pCAGGS-S1和pCAGGS-S2真核表达质粒。间接免疫荧光和Western-blot实验表明,转染后S1和S2都能在Vero细胞内表达,且转染48h后的表达量较高;其中S1蛋白分子量约为90kDa,S2蛋白分子量约为60kDa。流行毒株SHpd/2012的S1与S2两肽段的成功表达,为之后进一步研究PEDV与Vero细胞的相互作用奠定了基础。 相似文献
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利用反向遗传操作技术,猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）也可以被用作外源基因表达的活载体。前期研究将猪瘟病毒E2蛋白的编码基因插入了高致病性PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112的非结构蛋白和结构蛋白编码间区,所拯救的重组病毒rPRRSV-E2能够在体外和体内高效表达E2蛋白。能够为猪瘟和HP-PRRS的感染提供100%的免疫保护。本研究利用rPRRSV-E2的全长感染性克隆平台,在PRRSV基因组ORF7和3’非翻译区之间插入了转录调控序列6(TRS6)和绿色荧光蛋白的编码基因,构建并拯救了重组病毒rPRRSV-E2-EGFP,该病毒感染MARC-145细胞后,可以同时表达猪瘟E2蛋白和EGFP。外源序列在载体中能够保持遗传稳定。本研究为开发PRRSV作为病毒活载体疫苗提供了一个新的外源基因插入位点和构建策略,对今后多价疫苗的研发有重要意义。 相似文献
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为弄清2013年年初上海某猪场发生的仔猪腹泻疫情病因,本研究随机采集发病猪场的仔猪腹泻样品9份,利用RT-PCR方法对采集样品进行病原检测。结果显示,9份临床样品中有4份为猪轮状病毒阳性,而猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒均为阴性。根据GenBank公布的猪轮状病毒参考株序列设计两对引物,对其中阳性样品的VP6和VP7基因进行RT-PCR扩增、基因克隆和序列测定分析。结果显示,4份阳性样品的VP6基因大小为1356 bp,VP7基因大小为1100 bp;序列分析结果显示,VP6基因与A群代表株OSU的氨基酸同源性为64.1%~87.0%,与代表株Gottfriend的氨基酸同源性为26.3%~60.8%;VP7基因与不同G型代表株的氨基酸同源性为71.8%~97.3%。根据上述结果分析,我们推测引起此次仔猪腹泻疫情中的主要病原是由属于A群G9血清型的猪轮状病毒引起,本研究为此次仔猪腹泻疫情的诊断提供了依据。 相似文献
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研究旨在利用哺乳动物细胞悬浮培养系统表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p17蛋白,纯化并免疫小鼠,制备针对ASFV p17蛋白的特异性多克隆抗体。根据GenBank中公布的ASFV SY18毒株p17蛋白编码基因序列,设计特异性引物扩增p17基因片段,构建重组真核表达质粒pCDNA3.1-p17-strep。将其瞬时转染293i细胞,并利用下游strep标签进行蛋白纯化。纯化后的重组p17蛋白配合MnJ(β)胶体锰佐剂免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体血清。利用Western blot、间接免疫荧光试验鉴定该多克隆抗体的反应原性和特异性。结果显示：本试验成功构建pCDNA3.1-p17-strep真核表达质粒,转染293i细胞后纯化获得重组p17蛋白。免疫小鼠后制备的多克隆抗体与真核表达的p17蛋白及表达ASFV p17蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒均有良好的特异性免疫反应。本试验为深入探讨ASFV p17蛋白的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株感染性分子克隆的建立及拯救病毒的鉴定 总被引：1，自引：1，他引：0
为构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆,本实验根据PRRSV HuN4株基因组序列设计并合成PRRSV特异性引物,应用RT-PCR技术分6段扩增了PRRSV HuN4株全基因组cDNA.将扩增的各个cDNA部分重叠片段分别克隆于pBlueScript Ⅱ SK(+)载体中构建了感染性重组质粒pHuN4.并在病毒cDNA 5′末端引入sp6启动子序列便于后期的体外转录获得病毒的转录本,在3'末段Poly (A)尾引入Not Ⅰ酶切位点用于线性化pHuN4;此外,将HuN4基因组第14680位的A沉默突变为G产生一个Mlu Ⅰ酶切位点作为鉴定拯救病毒的分子标记.pHuN4通过酶切线性化后经体外转录及转染BHK细胞,并在Marc-145细胞中救获病毒.结果显示:救获的病毒能够在Marc145细胞引起明显的细胞病变;间接免疫荧光检测以及分子标记验证结果表明病毒拯救成功,而且拯救的病毒与亲本强毒生长曲线没有显著差异.利用拯救的第5代克隆病毒株对本动物进行致病性试验,结果显示实验猪在感染后第3d开始出现体温升高、厌食、消瘦等临床表现,发病率达100％,在感染后20 d内陆续死亡,表明拯救的病毒保持了与亲本病毒株相一致的致病特征,以上研究证实我们成功的构建并获得PRRSV强毒HuN4株感染性克隆,为从基因水平上研究PRRSV的致病机制提供了技术平台. 相似文献
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快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金免疫层析方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
为建立一种快速、简便、灵敏的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的胶体金免疫层析方法(GICA),本研究采用柠檬酸三钠还原法制备了胶体金颗粒,标记抗PRRSVN蛋白的单克隆抗体(MAb) 2D7制备免疫检测探针,将抗PRRSVN蛋白的MAb 1G7和羊抗鼠IgG抗体印迹在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线,经条件优化,组装成胶体金免疫层析试纸条.本研究制备的PRRSV胶体金试纸条的最低检测限度为103.0 TCID50/mL;在特异性试验中,试纸条检测PRRSV呈阳性,其它主要猪病病原均为阴性;不同批次试纸条重复检测,结果无差异;对现地猪场送检的150份病料进行PRRSV病原检测,与RT-PCR相比较,试纸条的特异性和敏感性分别为98.13％和88.37％.两种方法的一致性Kappa值为0.882.建立的PRRSV抗原胶体金免疫层析检测方法具有良好的的敏感性、特异性、重复性及现地应用性.该试纸条的研制为PRRS的快速诊断及免疫预防提供了技术手段. 相似文献
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猪白细胞介素-12的分子克隆与序列测定 总被引：5，自引：0，他引：5
为研究白细胞介素-12在机体免疫应答中的作用。从猪外周血提取单个核细胞（PBMCs)，用含LPS的培养基培养细胞，从培养2h和12h的活化细胞中分别提取总RNA，用RT-PCR方法扩增出编码猪IL-12两个亚基的基因，其大小分别为720bp(P35)和1044bp(P40)，将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化，用SacI和SalI双酶切后，分别将其连接至pUC18质粒上，进行质粒PCR和SacI,SalI双酶切鉴定后筛选阳性克隆，并进行序列测定和分析，序列分析表明P35基因开放阅读框含有669个核苷酸，序列与人，小鼠和羊同源性分别为79.2%,37.6%,86.1%,P40基因开放阅读框含有975个核苷酸，与人和小鼠，羊基因序列的同源性分别为79.5%,53.1%,84.3%。结果表明克隆到了猪白细胞介素-12P35和P40两个亚基的基因，得到的P35基因序列与国外报道完全一致，P40基因序列与发表的序列有4个碱基差异，提示P40基因可能存在多态性。 相似文献
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猪白细胞介素-10的分子克隆与序列测定 总被引：2，自引：0，他引：2
从LPS活化的猪外周血单个核细胞（PBMC）提取总RNA，用RT-PCR方法扩增出猪白细胞介素-10（IL-10）的编码基因，将其连接到pUC18质粒上，然后进行BamHI和HindⅢ双酶切鉴定筛选阳性克隆，序列分析结果表明该基因开放阅读框由528个核苷酸组成，推测产生的编码产物由175个氨基酸组成。猪IL-10基因与人、大鼠和小鼠基因序列的同源性分别为84%、79%和795，与国外报道的猪IL-10基因序列完全一致，试验成功克隆到了猪IL-10基因。 相似文献