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采用PCR定点突变技术,将家蝇(Musca domestica)防御素抗菌肽成熟肽段的基因(des-hf)第32位氨基酸残基由甘氨酸(G)突变为带正电荷的精氨酸(R),构成第一个突变体des-hf-MU1;采用同样的方法在des-hf基因的C端加上6个带有正电荷的赖氨酸(K),构成第2个突变体des-hf-MU2.采用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统对上述2个突变体进行表达.抗菌特性表明,抗菌肽突变体对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)有较好的抑菌活性.琼脂孔扩散法检测des-hf-MU1和des-hf-MU2的抑菌效价比des-hf分别提高了2.4和8.0倍.酸稳定性试验显示,抗菌肽突变体在pH值为5～6时活性最高,热稳定性试验显示des-hf-MU1和des-hf-MU2 100℃加热10 min后仍具有抑菌活性.显示了两抗菌肽突变体具有良好的应用前景. 相似文献
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为探究免疫增强剂CVC1302诱导机体产生高亲和力抗体的免疫机制,本研究利用4-羟基-3-硝基苯乙酰基耦联鸡卵白蛋白(NP-OVA)与免疫增强剂CVC1302配伍后,与ISA206佐剂乳化制备疫苗。将33只6周龄BALB/c雌性小鼠随机分为3组,分别后腿肌肉注射NP、NP-ISA206和NP-CVC1302-ISA206,每只100 μL疫苗,50 μg NP-OVA/只,利用ELISA检测高亲和力NP特异性抗体水平;利用流式细胞仪分析生发中心B细胞增殖水平、生发中心 B细胞诱导活化的胞苷脱氨酶(AID)表达水平;利用荧光定量PCR检测AID基因和HoxC4基因转录水平。结果表明:1)免疫增强剂CVC1302可诱导小鼠产生高亲和力的NP特异性抗体。2)免疫增强剂CVC1302可显著提升抗原特异性生发中心 B细胞数量占总B细胞数量比例。3)免疫增强剂CVC1302可显著增加生发中心 B细胞HoxC4基因转录水平。4)免疫增强剂CVC1302可显著增强生发中心B细胞AID蛋白表达水平。生发中心B细胞表达的AID可针对B细胞免疫球蛋白序列可变区进行点突变,发生体细胞高频突变,提升B细胞BCR针对抗原的亲和力,进而在辅助性T细胞的阳性选择下分化为长寿浆细胞,持续性分泌高亲和力抗体,因此本研究推断免疫增强剂CVC1302依赖于正向调控AID诱导机体产生高亲和力抗体,为机体提供免疫保护力,以抵抗病原体的感染,为后续新型免疫增强剂的研制提供思路和理论基础。 相似文献
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[目的]本试验旨在分析乙型脑炎病毒(JEV)感染猪睾丸(ST)细胞和正常ST细胞miRNA差异表达谱,以探索miRNA在JEV感染过程中的作用及其调控机制。[方法]分别提取正常ST细胞和JEV感染8 h后的ST细胞总RNA,利用高通量测序技术检测分析ST细胞中的miRNA表达谱并进行差异分析。使用miRanda软件对表达差异显著miRNA的靶基因进行预测并对靶基因进行GO分析。选取6个显著性差异表达的miRNA通过RT-qPCR进行验证。[结果]与正常ST细胞相比,JEV感染后的ST细胞有112个差异表达miRNA,其中80个miRNA上调表达,32个miRNA下调表达。经RT-qPCR方法验证6个差异表达的miRNA结果与高通量测序结果一致。差异表达miRNA靶基因的生物学功能相对集中在细胞代谢、细胞黏附等生物过程。[结论]检测和分析JEV感染后猪睾丸细胞的miRNA表达谱,获得了大量的与JEV感染相关的miRNA表达谱数据,为揭示JEV感染生殖系统致病机制提供了有效的数据和理论基础。 相似文献
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重组家蝇抗菌肽Des-HF在酵母中的表达及对金黄色葡萄球菌的抗菌活性 总被引：3，自引：0，他引：3
参考家蝇防御素抗菌肽基因序列(AY260152) 设计4条引物,用降落PCR方法获得家蝇防御素抗菌肽成熟肽基因.将基因克隆人酵母表达载体pPICZα-A,构建分泌型重组酵母表达载体pPIC-Des-HF,转化Pichia pastoris受体菌SMD1168,在醇氧化酶(AOX) 启动子调控下,相对分子质量约5 000的重组抗菌肽Des-HF获得表达.抗菌试验结果表明,该表达产物对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性.以小鼠为试验模型研究重组抗菌肽对金黄色葡萄球菌的体内抗菌活性,试验结果表明,240μg重组Des-HF可分别保护小鼠免受10倍最小致死浓度的金黄色葡萄球菌(ATCC26003) 和Cowan I的攻击. 相似文献
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为了了解疫苗的使用剂量与抗体消长规律的相互关系,并降低生产成本,通过对大耳白兔接种兔出血症病毒(RHDV),无菌分离各个组织后,应用血凝试验和RT-PCR方法检测各组织的血凝效价和基因;制备RHD组织灭活疫苗接种成年兔,进行1～6周抗体消长规律研究.血凝试验结果为肝脏的血凝效价最高,其次为脾脏、骨髓、心脏、肾脏、肌肉、淋巴结、脑组织,肺脏最低;对照组的组织血凝效价均为阴性.所有组织经RT-PCR检测均检出目的基因,对照组均未检测到目的基因.不同剂量接种兔后1～6周均检测到抗体.结果表明:2种试验方法检测结果相符;雌雄个体阳性检测率差异不显著;接种剂量大的试验组产生的抗体水平较高;接种血凝效价为160的疫苗时可达到保护作用;病死兔的组织均可以制备疫苗用于免疫动物. 相似文献
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为了给伪狂犬病病毒(PrV)UL24蛋白的细胞定位和功能研究提供参考依据,据GenBank公布的PrVUL24基因序列(登录号NC006151)设计1对引物,以质粒pUL24-GFP为模板,用PCR方法扩增出部分缺失的基因片段mUL24(modified UL24)。将mUL24片段定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建融合表达载体pET-UL24。阳性质粒转化宿主菌E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导,重组蛋白(His)6-UL24以包涵体的形式获得表达。用纯化后的pET-UL24融合蛋白免疫家兔,ELISA分析表明,在血清效价达到1∶2 560以上,Western-blot分析制备的抗体可以和pET-UL24表达产物发生反应,具有良好的免疫特异性。 相似文献
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采用毕赤酵母表达的猪瘟病毒(CSFV)重组E2蛋白免疫BALB/c小鼠，经间接免疫荧光(IFA)筛选，获得了17株特异性单抗。经病毒中和试验(VNT)验证，上述单抗均具有CSFV中和活性，其中单克隆抗体3H9的病毒中和效价最高，大于1∶10 240。采用HRP标记的CSFV单抗3H9为阻断抗体，配合酵母表达的CSFV E2蛋白作为包被抗原，建立了一种用于检测猪血清中CSFV中和抗体的阻断ELISA方法。该方法优化后的抗原包被浓度为0.5μg/mL,阻断抗体稀释度为1∶8 000。通过对100份阴性猪血清的检测，确定该方法的阻断率cut-off值为30%。该方法敏感性高，对中和抗体效价低至1∶16的血清检测仍呈阳性；特异性强，仅与CSFV抗体阳性猪血清呈阳性反应，与其他猪病病毒及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体阳性猪血清均呈阴性反应；良好的可重复性，批内、批间变异系数分别为0.90%～3.21%、1.89%～6.57%,均小于10%。对188份现有猪血清检测结果显示，该方法与病毒中和试验和IDEXX猪瘟病毒抗体检测试剂盒的符合率分别为96.3%、94.7%。用该方法对南京市浦口区某养殖场... 相似文献
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[目的]本研究旨在比较活/灭活病毒进入体内后对免疫系统活化的差异，为免疫增强剂的筛选和评价建立高效动物模型。[方法]本试验利用伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株建立小鼠伪狂犬人工感染模型，筛选活/灭活病毒接种小鼠后免疫相关差异因子。将PRV Bartha-K61活毒以不同剂量、不同方式感染小鼠，通过计算小鼠存活率确定最佳感染剂量与感染方式；将筛选的最佳剂量的伪狂犬病毒活毒与相同剂量下灭活病毒按照前述筛选的最佳感染方式接种小鼠，利用ELISA试剂盒检测免疫7 d后小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IFN-β和IL-6水平；利用PRV gB ELISA检测免疫7 d后小鼠血清PRV特异性gB抗体水平；利用灭活PRV作为特异性抗原进行淋巴细胞增殖试验并计算各组淋巴细胞刺激指数(SI)。[结果]在保证小鼠存活的前提下，6～8周龄小鼠的PRV的安全感染剂量为5×104 TCID50;同等剂量下，相比于肌肉和腹腔注射，皮下注射为最安全的感染方式；同等剂量的活毒和灭活病毒接种小鼠后，与灭活病毒组相比，活病毒感染7 d后小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IFN-β水平显著... 相似文献
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为开发一种新型高效、低成本的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)抗原纯化方法，本研究尝试了一种基于凝集素(刀豆蛋白A，Con A)的PEDV浓缩纯化方法。通过Con A与PEDV病毒粒子的特异性结合，形成Con A-PEDV复合物，然后通过低速离心和竞争性解离即可实现病毒纯化。结果表明:1)当Con A的使用浓度为80 μg/mL，室温作用2 h，4 000 r/min离心15 min时，纯化效果较佳；2)利用Tris-HCl缓冲液(pH 7，0.01 mol/L，内含200 mmol/L甲基-α-D-吡喃甘露糖苷和50 mmol/L NaCl)进行解离时，较PBS缓冲液有更高的解离效率；3)该方法病毒回收率大约为80%，总蛋白去除率可达90%。综上，本研究利用Con A纯化PEDV是可行的，为高质量PEDV灭活疫苗的研发奠定基础。 相似文献
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为建立评价猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗免疫效力的方法，本研究利用纯化的PEDV免疫BALB/c小鼠，按照常规方法制备PEDV全病毒单克隆抗体(MAb)作为捕获抗体，PEDV细胞培养上清为夹心抗原，HRP标记的羊抗猪IgA为二抗，采用棋盘滴定法对各反应条件优化后建立了用于猪初乳中PEDV IgA检测的捕获ELISA方法，并确定其临界值为0.25。采用该捕获ELISA对PEDV、PCV2b、PRRSV、PRV、JEV、PPV、FMDV与CSFV IgA抗体阳性猪初乳进行检测，结果显示，除PEDV IgA抗体阳性猪初乳检测结果为阳性外，其他病毒抗体阳性猪初乳检测结果均为阴性，表明该方法特异性强。采用该方法和BIONOTE PEDV IgA试剂盒对从1∶10开始2倍倍比稀释的16个稀释度的阳性猪初乳样品检测，结果显示该方法对阳性样品检测的最大稀释度为1∶40 960，是BIONOTE PEDV IgA试剂盒敏感性的16倍(1∶2 560)，表明本研究建立方法的敏感性高。分别采用同一批次和不同批次制备的MAb包被的ELISA板分别检测5份PEDV IgA抗体阳性和1份PEDV IgA抗体阴性... 相似文献