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甲型H1N1与季节性H1N1流感病毒检测基因芯片的制备与初步应用 总被引：2，自引：0，他引：2
建立DNA微列阵技术检测甲型H1N1和季节性H1N1流感病毒的方法,进而探讨该方法用于检测临床标本的可行性。通过生物医学数据库甲型H1N1流感病毒及季节性H1N1亚型流感HA与NA基因进行检索和筛选,应用分子生物学软件,进行序列分析、引物及探针设计,并进行验证。试验所设计的探针可以对甲型H1N1流感与季节性H1N1流感病毒进行区分,用该方法检测了长春市CDC送检的6份疑似甲型H1N1流感病毒临床病例,4份阳性,检测结果同实时荧光定量PCR方法一致。结果表明,利用本研究建立的DNA微列阵技术检测甲型H1N1流感病毒方法,特异性和敏感性强,可作为甲型H1N1流感病毒临床标本检测方法。 相似文献
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本研究旨在制备猪甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)蛋白的特异性单克隆抗体.采用RT-PCR方法扩增猪甲型H1N1流感病毒的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS上,获得重组质粒pCAGGS-HA,转染293T细胞,通过间接免疫荧光(IFA)检测表明HA蛋白在293T细胞中得到表达.将pCAGGS-HA以100 μg·只-1剂量免疫5周龄BALB/c小鼠,获得4株稳定分泌抗HA蛋白单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株,分别命名为11G7、3C10、3G3和2B11.其中11G7诱导小鼠产生的腹水HI效价为14log2,中和效价为1:8 192,HI试验结果进一步表明11G7只与甲型H1N1流感病毒发生反应,而不与其他H1N1、H1N2、H3N2、H5N1及H9N2亚型流感病毒反应.该MAb的制备将为建立猪甲型H1N1流感病毒与传统亚型SIV的鉴别诊断方法奠定基础. 相似文献
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为建立快速检测甲型H1N1流感病毒[Influenza A(H1N1)pdm09]的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究根据甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因保守序列,设计并合成了特异性引物和TaqMan MGB探针,采用实时荧光定量PCR技术检测甲型H1N1流感病毒。使用含有选定检测序列的重组质粒pMD-HA标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.999,敏感性可达50 TCID50。本研究中,甲型H1N1流感病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法与经典H1N1、类禽H1N1、类人H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2流感病毒无交叉反应。结果表明,该方法可以在人类和动物间有效地检测甲型H1N1流感病毒。 相似文献
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为了建立快速检测新型甲型H1N1流感病毒的多重PCR技术,根据GenBank中公布甲型H1N1流感病毒(2009年流行株)的HA和NA基因序列,设计并合成两套特异性引物。使用TaKaRa公司的一步法RT-PCR试剂盒和自行设计合成的引物建立多重RT-PCR反应,按照预期的PCR产物序列合成的DNA作为阳性对照。结果表明,该方法具有良好的特异性,可以将甲型H1N1流感病毒(2009年流行株)与传统甲型H1N1、H3N2、H5N1、H6N2和H9N2亚型流感病毒区分。该方法同时具有较高的灵敏度,最低可以检测到100个拷贝的阳性克隆质粒。在对183份发热病人临床咽拭子样品检测中发现了10份阳性样品,对350份猪鼻腔拭子样品检测全部呈阴性,结果与中国检验检疫科学研究院试剂盒检测结果一致,说明了该多重RT-PCR方法在临床检测新型甲型H1N1流感病毒方面具有广阔的应用前景。 相似文献
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为制备H1N1猪流感病毒HA蛋白单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),本试验利用表达猪流感病毒A/Swine/Guangdong/2004(H1N1)毒株HA蛋白的表达质粒pVAX1-HA肌注股内肌免疫BALB/c小鼠,将其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合;通过间接ELISA方法筛选和有限稀释法克隆,获得9株稳定分泌抗HA单克隆抗体的杂交瘤细胞。中和试验结果显示,单克隆抗体4D5株对H1N1流感病毒起中和作用,该单克隆抗体杂交瘤细胞培养上清的效价为1∶1024。这株单克隆抗体与哈尔滨兽医研究所国家重点实验室保存的H3N2流感病毒、H5N1流感病毒均不发生交叉反应,显示出了很好的H1特异性;间接免疫荧光试验结果显示,这株单克隆抗体能与H1N1流感病毒发生特异性反应。制备的特异性抗HA单克隆抗体为建立H1N1流感病毒免疫学检测方法和单链抗体抗病毒复制研究奠定了基础。 相似文献
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流感病毒血凝素(HA)被宿主蛋白酶切割活化是流感病毒复制和扩散的关键步骤.2009甲型H1N1流感病毒HA的裂解位点为单碱性氨基酸,只能被宿主特定组织部位表达的某些蛋白酶所切割活化.本研究构建了主要存在于人呼吸道和肺脏的跨膜丝氨酸蛋白酶4 (TMPRSS4)的真核表达重组质粒pCA-TMPRSS4-Flag与表达2009甲型H1N1流感病毒中国四川分离株HA的真核重组表达质粒pCA-SCHA共转染293T细胞,利用westernblot证明2009甲型H1N1流感病毒的HA蛋白能够被TMPRSS4切割;通过激光共聚焦确定TMPRSS4和HA在293T细胞膜上共定位;并进一步通过细胞融合试验证明经正确切割的HA具有在低pH条件下介导细胞膜发生融合的生物学功能.本实验为研究自然感染情况下参与活化流感病毒的宿主胰蛋白酶提供了实验依据. 相似文献
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自甲型H1N1(2009)流感病毒于2009年在世界多个国家暴发流行后,许多国家的猪群中检测到该病毒的存在,因此建立快速准确的甲型H1N1流感病毒的检测方法成为迫切需求。本研究针对甲型H1N1(2009)流感病毒NA基因设计特异性引物和探针,建立甲型H1N1(2009)流感病毒特异性实时荧光RT-PCR快速检测方法。并将该方法与WHO推荐美国CDC建立的检测方法和美国农业部推荐的检测方法进行比较。通过田间试验验证该方法在实际应用中的效果。结果表明:本研究建立的方法对检测甲型H1N1流感病毒裂解疫苗的灵敏度达到10-6,与WHO推荐的A型流感病毒实时荧光PCR检测方法的灵敏度一致,并且高于美国农业部推荐方法的检测灵敏度(10-5);该方法特异性强,与经典型H1N1和其他亚型流感病毒株无任何交叉反应。与香港兽医化验所进行了检测比对,检测灵敏度和特异性完全一致。近3 800份的田间试验表明,所建立的方法准确可靠。本研究所建立检测方法快速灵敏,检测结果准确可靠,适合用于甲型H1N1(2009)流感病毒的分子生物学检测和监测。 相似文献
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为获得重组表达的H5亚型流感病毒血凝素(HA1)抗原.将PCR扩增的H5亚型流感病毒HA1基因克隆到原核表达载体pET-28a,构建重组原核表达质粒pETHA1-H5.结果显示,转化pETHA1-H5的大肠杆菌BL21(DE3)在IPTG的诱导下以包涵体形式表达了HA1蛋白.HA1重组蛋白能与不同禽类(鸡、鸭和鹅)H5亚型流感病毒阳性血清发生特异性反应,同时以HA1重组蛋白为抗原制备的单克隆抗体具有与H5亚型完整病毒粒子抗原反应的能力,说明重组表达的HA1蛋白保留了自然条件下H5亚型流感病毒的抗原特征.将重组表达的HA1蛋白作为ELISA抗原检测禽血清中的H5亚型流感病毒抗体,以HI试验结果为参考,两者的符合率为96.6%,证明HA1重组蛋白作为ELISA检测抗原是可行的. 相似文献
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为研究小反刍兽疫病毒N蛋白抗体与H蛋白抗体在羊体内的代谢消长规律,试验通过建立小反刍兽疫N蛋白双抗原夹心ELISA抗体检测方法、H蛋白阻断ELISA抗体检测方法与血清中和抗体试验方法,分别检测了羊免疫疫苗后体内N蛋白抗体与H蛋白抗体在每个免疫阶段的代谢消长变化。结果表明:羊免疫小反刍兽疫疫苗后,血清内的N蛋白抗体与H蛋白抗体在6~8周时血清抗体效价较高,对应的羊体内中和抗体效价为1∶512,且效价至少可以持续到10周以上,2种抗体具有一定消长代谢规律的相关性。该研究结果也为以N抗原与H抗原为基础建立相应的抗原捕获ELISA方法、竞争ELISA检测方法、间接ELISA检测方法以及双抗原夹心ELISA检测方法奠定了一定的理论依据。 相似文献
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猪流感病毒HA基因的原核表达及其ELISA检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据H1N1亚型猪流感病毒血凝素基因序列设计并合成特异性引物,从本室保存的H1N1亚型猪流感病毒中扩增信号肽和跨膜区缺失的血凝素基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a中,在大肠埃希菌中诱导表达.对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blot的结果表明,HA基因在大肠埃希菌中获得表达,产物具有免疫学活性,表达蛋白分子质量约为55 ku.表达产物经过纯化作为包被抗原建立了检测H1亚型猪流感抗体的间接ELISA方法.该方法具有较高的特异性和敏感性,重复性良好.应用该方法对2006年2 584份临床猪血清进行检测,结果显示多个地区检测猪流感抗体出现阳性,平均为20.5%.在6月、7月和12月分别出现抗体水平高峰,分别高达25.4%、25.0%和35.5%. 相似文献
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目的以H5亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的血凝素(HA)抗原表位重组表达蛋白为抗原,探索H5亚型AIV单克隆抗体制备的简便有效途径。方法利用H5亚型AIV的HA抗原表位原核表达重组蛋白为抗原,4次免疫8～10周龄雌性BALB/c小鼠后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA方法筛选能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的特性及初步应用价值进行测试。结果得到一株能稳定分泌针对H5亚型AIVHA抗原表位的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株,单克隆抗体ELISA效价达1:5×104,为具有IgK轻链的IgM亚类。该单克隆抗体能特异性地与H5亚型AIV产生肉眼可见的WesternBlot免疫印迹反应,与其它供试的禽病抗原无反应。H5N1亚型AIV阳性血清能有效阻断辣根过氧化酶标记的单克隆抗体与HA抗原表位重组蛋白的结合。结论本研究探索出一条利用H5亚型AIV的HA抗原表位重组表达蛋白为抗原的单克隆抗体制备的简便、高效途径,所制备的单克隆抗体稳定性好、效价高、特异性强,在H5亚型禽流感病毒及其血清学检测中有较高的应用价值。 相似文献
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焦磷酸测序技术在确证猪甲型H1N1流感病毒中的应用 总被引：1，自引：0，他引：1
目的本研究旨在通过对猪甲型H1N1流感病毒进行序列信息分析的基础上,利用焦磷酸测序技术建立一种快速、简单地确证猪甲型H1N1流感病毒的方法。方法通过序列信息比对,设计H1HA和N1NA基因保守区段的扩增引物及测序引物。从感染猪甲型H1N1病毒的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,RT-PCR扩增目的基因片段,采用焦磷酸测序技术(PSQ)针对HA基因和NA基因进行保守核苷酸区段的测序分析。利用扩增引物与其他猪源病毒进行特异性试验,利用测序引物进行重复性试验。将该方法与病毒分离和荧光定量RT-PCR方法做临床样品的平行检测,并比较结果。结果通过序列信息比对寻找到表征H1N1亚型的核苷酸保守区段,经焦磷酸测序后能进一步确证毒株的序列信息为猪甲型H1N1流感病毒。特异性试验表明,不与其他猪源病毒发生交叉反应;重复性试验表明,重现性为100%。对221份临床样品检测表明,病毒分离鉴定与焦磷酸测序方法结果符合率为96.8%,与TaqMan荧光定量方法检测结果符合率90.3%。经统计学分析,焦磷酸测序确证与病毒分离鉴定在检测临床样品上,两者差异不显著。结论基于序列分析的焦磷酸测序技术可以作为进一步确证方法使用。 相似文献
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禽流感病毒H5HA、H7HA基因共表达核酸疫苗质粒的构建及其在体外的表达 总被引：4，自引：0，他引：4
为了获得既能对 H5亚型又能对 H7亚型 AIV攻击产生保护的核酸疫苗 ,设计构建了含有双顺反子的真核表达载体 ,用限制性内切酶从 PCIH7HA载体上切得 AIV H7HA基因的c DNA,此 c DNA含有 CMV启动子和 Poly(A)终止序列 ,使用 DNA 连接酶引入载体PCIH5HA中 ,最后获得双顺反子真核表达载体PCI-H5HA-H7HA,其中 H5HA和 H7HA基因都带有自己的 CMV启动子和 Poly(A)终止序列。选用 2 93 -T真核表达细胞系 ,用脂质体转染法导入细胞进行瞬时表达 ,转染后 48h用荧光标记的兔抗鸡 Ig G进行间接免疫荧光试验。结果表明双顺反子真核表达载体构建正确 ,且在真核表达细胞系中 H5HA和 H7HA基因都能获得表达 ,且 H5HA 基因的表达效果优于H7HA。这为进一步的动物免疫试验和疫苗效价检测试验奠定了基础 相似文献
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利用PCR技术亚克隆了H7亚型禽流感病毒的HA1基因,并将PCR产物连接到克隆载体pMD 18-T Simple vector,转化大肠杆菌。测序结果表明所克隆的片断大小为1035bp。将HA1基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,经酶切和PCR鉴定,证明成功构建了重组表达载体pGEX-HA1。将构建好的融合表达载体在IPTG的诱导下在大肠杆菌中得到了表达。融合蛋白GST-HA1的分子量为63ku。Western-Blot和ELISA鉴定结果表明,融合蛋白与H7亚型禽流感阳性血清发生特异性反应,而与H5、H9亚型抗血清不发生反应。 相似文献
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为了建立适用于临床诊断的H1N1亚型猪流感病毒快速检测方法,本研究根据GenBank已登录的H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因序列设计RT-PCR扩增引物,以H1N1亚型猪流感病毒、H3N2亚型猪流感病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒为试验对照,通过优化RT-PCR反应条件和反应体系,建立了H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因双重RT-PCR定型检测方法。同时,运用H1N1亚型猪流感病毒血凝和血凝抑制试验方法和本研究建立的方法对165份猪病料样品进行了对比验证。结果表明,本研究建立的H1N1亚型猪流感病毒双重RT-PCR具有良好的特异性、敏感性、重复性,所扩增的目的基因片段大小分别为428 bp和678 bp左右,可检出最小基因组RNA浓度为2.9×10-5μg/μL。本研究建立的方法和H1N1亚型猪流感病毒血凝和血凝抑制试验方法均从同一份猪肺脏样品中检测出H1N1亚型猪流感病毒,其余样品中均未检出H1N1亚型猪流感病毒,两种方法符合率为100%。本研究建立的方法适用于H1N1亚型猪流感病毒双基因定型检测,可在H1N1亚型猪流感病毒流行病学调查和临床诊断中应用。 相似文献
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以H5N1亚型虎源流感病毒免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA试验检测细胞培养上清,获得2株阳性杂交瘤细胞克隆株,命名为3A13和1B8.分别制备腹水后进行纯化,获得了抗H5亚型虎源流感病毒血凝素的单克隆抗体,用制备的单克隆抗体结合胶体金免疫层析技术,制备了H5亚型虎源流感病毒免疫胶体金快速诊断试纸条.该试纸条对H5N1虎源流感病毒鸡胚培养毒、H5亚型禽流感病毒标准抗原,以及24份虎疑似感染H5N1亚型虎源流感病毒感染病料和小鼠模型病料等检测结果为阳性,同时对H7和H9亚型禽流感病毒标准抗原及传染性支气管炎、新城疫抗原等检测结果为阴性;与HA-HI和RT-PCR的平行对比试验表明,试纸条检测敏感度与血凝试验和血凝抑制试验的敏感性相符.本试验所研制的免疫胶体金诊断试纸条可用于H5亚型虎源流感病毒的特异诊断和流行病学调查,为开发成品化检测试纸条奠定基础. 相似文献
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为建立一种快速、简便、准确的方法以诊断和检测H1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV),试验根据H1亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计并合成1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,建立检测H1亚型SIV的一步法实时荧光定量RT-PCR技术。结果显示,该方法的敏感性可达102拷贝/μL,除H1亚型SIV外,对H3N2亚型SIV、H9N1亚型SIV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒的检测均为阴性,且应用该方法对疑似猪流感样品进行检测,其结果与SPF鸡胚分离病毒方法结果的符合率为94%。本试验结果表明该方法特异性强、重复性好,有望成为一种特异、敏感、快速、定量检测H1亚型SIV的方法。 相似文献
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猪流感病毒H1、H3、N1、N2亚型分型 RT-PCR方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中H1N1和H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(neuraminidase,NA)和M基因保守序列,分别设计合成了5对特异性引物,利用RT-PCR技术对SIV的型和亚型进行鉴定。结果表明,该方法的型RT-PCR可以检测出104 EID50病毒量所提取的RNA;H1、H3、N1和N2的亚型RT-PCR均可以检测出104 EID50病毒量所提取的RNA。除每对特异性引物所对应的亚型外,对其他亚型及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的检测均为阴性,应用该方法对临床样品进行检测,其结果与病毒分离结果符合率为100%。结果表明,该方法特异性好、敏感性高,有望成为SIV的一种特异、敏感、快速的分型检测方法,为猪流感分子流行病学的调查奠定了良好的基础。 相似文献