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1.
为了给猪圆环病毒病的诊断及防制提供科学依据,试验参考GenBank中猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2) ORF1基因序列,设计1对特异性引物,进行ORF1基因的PCR扩增,扩增出PCV2贵州株ORF1基因片段。扩增产物与pMD18-T载体连接、鉴定正确后,再亚克隆至pET-30a(+)原核表达载体中,经双酶切鉴定后测序。结果表明,ORF1基因在pET-30a(+)载体中位置正确,pET30a-PCV2-ORF1原核表达质粒构建成功,转化至Rosetta菌,用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE检测,结果显示PCV2-ORF1在pET-30a(+)中获得了高效融合表达,其表达蛋白分子质量约为42 ku。重组蛋白主要以包涵体的形式表达,包涵体洗涤溶解后,采用Ni2+离子金属螯合亲和层析柱纯化蛋白,Western blotting分析结果表明,表达蛋白能和抗His标签的单克隆抗体反应。 相似文献
2.
用原核表达系统表达猪圆环病毒2型ORF3基因,分析ORF3蛋白的抗原性。根据GenBank上公布的猪圆环病毒2型(PCV-2)核苷酸序列进行分析,针对ORF3基因设计并合成1对特异性引物,PCR扩增该基因,并将此片段克隆入原核表达载体pET-32a(+)上,命名为pET32a-ORF3,转化大肠杆菌Rosetta-blue(DE3)pLacⅠ感受态细胞,1.0mmol/L IPTG37℃诱导表达。结果表明,PCR扩增得到315bp的片段,重组蛋白大小约为29ku,与预期大小相符。Western blotting分析结果表明,重组蛋白能与抗His-tag的单克隆抗体反应,不与PCV-2阳性血清发生反应。猪圆环病毒2型ORF3基因能在大肠杆菌中成功表达,但与阳性血清之间没有反应原性,为进一步研究PCV-2ORF3蛋白的功能及特性奠定基础。 相似文献
3.
猪圆环病毒2型ORF3基因的原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
用原核表达系统表达猪圆环病毒2型ORF3基因,分析ORF3蛋白的抗原性。根据GenBank上公布的猪圆环病毒2型(PCV-2)核苷酸序列进行分析,针对ORF3基因设计并合成1对特异性引物,PCR扩增该基因,并将此片段克隆入原核表达载体pET-32a(+)上,命名为pET32a-ORF3,转化大肠杆菌Rosetta-blue(DE3) pLacⅠ感受态细胞,1.0 mmol/L IPTG 37 ℃诱导表达。结果表明,PCR扩增得到315 bp的片段,重组蛋白大小约为29 ku,与预期大小相符。Western blotting分析结果表明,重组蛋白能与抗His-tag的单克隆抗体反应,不与PCV-2阳性血清发生反应。猪圆环病毒2型ORF3基因能在大肠杆菌中成功表达,但与阳性血清之间没有反应原性,为进一步研究PCV-2 ORF3蛋白的功能及特性奠定基础。 相似文献
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猪圆环病毒1型和2型Rep蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
分别以猪圆环病毒1型基因组和重组质粒pCI-PCV2-ORF1为模板,利用PCR扩增了猪圆环病毒1型和2型的ORF1基因,随后克隆到pET-28a( )和pET-32a( )两种原核表达载体上。测序正确的重组质粒分别转化E.coli BL21(DE3),进行目的蛋白的诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明,猪圆环病毒1型和2型的ORF1均能在pET-28a和pET-32a中分别以重组蛋白His-Rep(40 Ku)和Trx-His-Rep(54 Ku)的形式表达。进一步纯化后测定重组蛋白的浓度,推算出猪圆环病毒1型和2型的His-Rep蛋白产量分别为34 mg/L菌液和14 mg/L菌液,Trx-His-Rep蛋白产量则为12 mg/L菌液和10 mg/L菌液。这些纯化的蛋白在Western blot中能够与猪抗猪圆环病毒2型阳性血清发生特异性反应,显示其具有良好的免疫学活性。本研究建立的猪圆环病毒重组Rep蛋白的原核表达系统及其纯化方法,为下一步开展Rep蛋白功能等相关研究奠定了基础。 相似文献
5.
为原核表达猪圆环病毒2型(PCV2)的ORF3编码蛋白,本研究采用PCR方法以PCV2的CC株的基因组DNA为模板扩增ORF3基因,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21 (DE3),经IPTG诱导表达.SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白约为31ku,并且以包涵体形式存在;western blot分析表明,ORF3重组蛋白能够与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性反应,表明原核表达的ORF3重组蛋白具有良好的反应原性. 相似文献
6.
猪圆环病毒2型(porcine Circovirus type 2,PCV2)感染给养猪业造成巨大的经济损失,而PCV2ORF1、ORF2和ORF3与PCV2的复制、免疫原性及致病机理密切相关。本研究制备PCV2ORF1、ORF2和ORF3多克隆抗体,为进一步研究PCV2ORF1、ORF2和ORF3的功能提供材料。依据PCV2全基因组序列,分别设计针对PCV2ORF1、ORF2和ORF3编码基因的特异性引物,PCR扩增后,克隆入原核表达载体pET-32a的BamHⅠ/NcoⅠ和HindⅢ位点之间,经PCR、双酶切和测序鉴定正确的重组原核表达载体分别命名为pET-ORF1、pET-ORF2和pET-ORF3。重组质粒分别转化E.coli BL21菌株,1 mmol/L IPTG诱导表达ORF1、ORF2和ORF3重组蛋白,SDS-PAGE测定结果表明其相对分子质量分别约为52 000、39 000和29 000。大量诱导重组蛋白表达后,回收目的蛋白条带、匀浆后免疫新西兰大白兔,制备兔抗PCV2ORF1、ORF2和ORF3重组蛋白血清。兔抗血清纯化后,Western blot检测抗血清与重组蛋白的特异性结合情况及其效价,证明所制备多克隆抗体均具有较强的特异性,效价均高于1∶10 000。 相似文献
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根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因序列,设计合成了一对引物,对PCV1ORF2基因进行PCR扩增,将扩增出的ORF2基因(702bp)克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒命名为pMD-ORF2。由于ORF2前面有120多个信号肽和序列中有大量的稀有密码子,所以将ORF2进行改造并将改造的ORF2双酶切产物插入原核表达载体pET-32α与pET-41α,得到重组子命名为pET-ORF2-1与pET-ORF2-2。用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Westernblot分析,结果表明PCV1-ORF2在pET-32α和pET-41α中获得了高效融合表达,其表达蛋白分子量约为30Kda和45Kda。 相似文献
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本研究用PCR方法获得猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白基因,经酶切后将ORF2 3′端部分基因克隆至原核表达载体pGEX-6p-1中,转化大肠杆菌BL21,加入终浓度为0.3 mmol/LIPTG,在30℃诱导表达6 h后,经SDS-PAGE及western-blot分析,目的基因得到正确表达,大小约为40 ku。收集菌体并进行超声裂解后证实,表达产物以可溶蛋白与包涵体共同存在。对可溶蛋白与包涵体分别进行纯化,分别用做ELISA包被抗原检测PCV2抗体,结果两者无明显差异。 相似文献
9.
以病猪脾脏组织为材料,提取总RNA,通过RT-PCR得到579 bp的猪圆环病毒2型(PCV-2)/ORF2片段,与原核表达载体pET32a重组,通过菌落PCR鉴定、双酶切鉴定及测序鉴定后,证实重组质粒pET32a/ORF2构建成功,将其转化入表达菌Balgold,通过IPTG诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化目的产物,Western blot验证其免疫原性,重组蛋白免疫Balb/c小鼠,检测小鼠体内中和抗体滴度。获得的重组蛋白包涵体的形式出现,表达量占菌体总蛋白的30%,变性纯化后纯度达90%以上,Western blot证实重组蛋白能与PCV-2阳性血清发生反应,免疫Balb/c小鼠45 d后中和抗体滴度达到1∶22。 相似文献
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根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计了1对引物,应用PCR从广西PCV-2的DNA扩增出ORF2基因,将ORF2基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )载体上,获得重组质粒,经PCR酶切以及序列分析鉴定,表明插入的片段为ORF2目的基因,插入的位置、大小和阅码框均正确,成功构建了真核表达载体重组质粒pcDNA-PCV-ORF2。对阳性真核表达质粒pcDNA-PCV-ORF2大量抽提后,以每只小鼠0.2 mg免疫5周龄左右的雌性小鼠,然后用ELISA检测免疫小鼠血清中抗体的产生情况,同时进行pcDNA-PCV-ORF2的体内分布和安全性检测。结果表明,pcDNA-PCV-ORF2在小鼠体内广泛存在,产生了抗猪圆环病毒的特异性抗体,从第7天开始产生抗体,第28天抗体水平达到最高,抗体可维持7周以上,并具有良好的安全性。本研究通过对小鼠的免疫试验,产生了猪圆环病毒的特异性抗体,表明成功构建了能够在活体细胞中高效表达的真核表达载体,为进一步研究猪圆环病毒DNA疫苗奠定了基础。 相似文献
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两株猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆和序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计一对引物,从分离的PCV-2 GZ株、HN株的细胞培养物中扩增出ORF2基因(702 bp).将此基因片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-ORF2,并对其测序.结果表明,所克隆的ORF2基因与其他PCV-2的ORF2基因核苷酸序列同源性在90.6%～99.6%之间,推导的氨基酸序列同源性在88.9%～98.7%之间. 相似文献
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猪圆环病毒2型ORF2基因的表达及活性研究 总被引：1，自引：1，他引：0
根据猪圆环病毒2型(PCV-2)基因序列设计1对特异性引物,PCR扩增PCV-2去核定位信号(nuclear localization signal,NLS)的Cap蛋白基因(oRF2),经Bam H Ⅰ/HindⅢ双酶切后将其克隆到表达载体pQE30中并转化大肠埃希菌JM109,采用IPTG进行诱导表达,采用自行创新的纯化方法对表达的融合蛋白进行纯化,Western blot鉴定纯化后的重组Cap蛋白(rCap)活性.结果表明,成功克隆了无核定位信号的ORF2基因,其分子质量大小为579 bp;表达的rCap蛋白大小为24.1 ku左右,与预期大小相一致;经纯化后的rCap蛋白纯度在95%以上;Western blot鉴定结果表明,Cap蛋白可以和抗PCV-2抗体反应,具有很好的抗原性.本研究为进一步建立以Cap蛋白为包被抗原的PCV-2间接ELISA诊断方法以及PCV-2疫苗的研究奠定了基础. 相似文献
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根据 GenBank 中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV- 2)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR从疑似断奶仔猪多系统消耗综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出 ORF2 基因(702 bp)。将此基因片段克隆入 pMD -18 T载体,筛选获得重组质粒 pMD ORF2 并对其测序,结果表明所克隆的ORF2基因与德国分离株AF201897核苷酸序列同源性为99.5%与其它PCV- 2 的 ORF2 核苷酸序列同源性在92.1%~99.9%之间,推导的氨基酸序列同源性在90.2%~99.5%之间。 相似文献
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对所分离鉴定的猪圆环病毒2型(PCV-2)ZZ株,参照GenBank中PCV-2全基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR扩增出PCV-2ORF2片段,原核表达载体pET-32a(+)获得重组质粒pET-ORF2,IPTG进行诱导表述,并进行Western blot分析。结果表明,PCR扩增产物长度为702bp,大小与预期的一致,成功构建重组质粒,经IPTG诱导成功获得分子质量约为30ku的表达蛋白,该蛋白具有很好的免疫原性,为进一步研制PCV-2疫苗提供依据。 相似文献
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猪圆环病毒2型四川分离株ORF2基因的克隆与序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
对临床分离毒株PCV-2 sch2010 ORF2基因全序列进行了克隆和序列分析.结果表明,PCV-2sch2010 ORF2全基因共705 bp,编码234个氨基酸,与GenBank发表的21株PCV-2的ORF2参考序列的核苷酸氨基酸序列同源性分别为88.4%～99.7%和87.2%～99.6%;与2株PCV-1 ORF2(GU371908、FJ475129)的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为58.7%～59.5%和62.8%～64.5%;PCV-2 sch2010分离株与PCV-2的欧洲分支群亲缘关系较近. 相似文献
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猪圆环病毒2型ORF3编码蛋白的体外表达 总被引：1，自引：0，他引：1
设计特异引物,以猪圆环病毒2型(PCV-2)杭州株HZ0201的基因组DNA为模板,PCR扩增出ORF3基因,构建了pGEX-4T-1-ORF3原核表达载体和pEGFP-C2-ORF3真核表达载体。ORF3基因全长315 bp,编码105个氨基酸。SDS-PAGE、Western blot分析及真核PK15细胞转染结果显示:ORF3蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式存在,分子量大小约为37.7 ku;ORF3重组蛋白在真核PK15细胞的细胞核和细胞浆都有表达,尤其在细胞核中表达量较高,且对细胞有一定的毒性。 相似文献