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1.
参照GenBank中小反刍兽疫病毒（PPRV）H抗原基因序列，人工合成了PPRVH基因，将其克隆至PUC18-T质粒中，转化E．coli JM109感受态细胞，构建并选择PPRVH基因克隆重组质粒，经核苷酸序列分析正确，将其克隆至pBAD／Thio—TOPO载体中，转化E．coli TOP10感受态细胞，核苷酸序列分析证实，成功构建了PPRVH基因重组表达载体。经不同浓度L-阿拉伯糖诱导，可稳定、高效地表达PPRVH抗原。SDS-PAGE分析结果表明，用终浓度为0．2g／L的L-阿拉伯糖诱导5h的表达量最高，表达蛋白为分子质量约83ku的融合蛋白；经薄层扫描分析，其表达产量约占菌体总蛋白的10％。Western-blotting检测表明，诱导的蛋白能与PPRVH蛋白单抗发生特异性反应，说明表达的融合蛋白中含有PPRVH糖蛋白抗原。 相似文献
2.
猪瘟病毒E2基因抗原结构域A、B、C、D区在大肠杆菌中的表达 总被引：4，自引：0，他引：4
采用PCR技术扩增出猪瘟病毒E2基因抗原结构域A、B、C、D区并克隆于PGEM-T easy载体上，测序结果表明插入的为猪瘟病毒E2基因抗原结构域，切出目的基因，将目的基因克隆到表达质粒pProEX—HTb中，获得重组质粒经PCR、酶切和序列分析鉴定E2基因抗原结构域插入的位置、大小和读码框均正确，SDS—PAGE检测表明受体菌经IPTG诱导后能表达E2基因抗原结构域蛋白，Westernblot检测表明受体菌诱导表达E2基因抗原结构域蛋白可与猪瘟阳性血清发生特异性反应。 相似文献
3.
以PCR扩增猪带缃虫TS61抗原基因，与载体pUC18连接后进行测序；并构建了该基因的pGEX-1λT原核表达载体，制备了其原核表达产物，进行浓度梯度SDS－PAGE和免疫印迹分析，对该基因的碱基序列及其编码蛋白进行了同源性比较。结果表明，猪带绦虫TS61抗原基因含893对碱基，编码含70个氨基酸残基的多肽，分子质量为8.0ku，等电点为4.19。在基因库和欧洲分子学实验室数据库中均未发现该基因的同源序列。重组质粒在大肠埃希氏菌中表达的融合蛋白分子质量为34ku，该蛋白抗原能被兔抗猪囊尾蚴超免疫血清所识别。 相似文献
4.
猪瘟Erns基因在大肠杆菌中的高效表达 总被引：3，自引：0，他引：3
提取猪瘟病毒石门系强毒株的基因组RNA,用RT_PCR扩增其Erns基因的cDNA,将其克隆到原核表达载体pPROEXTMHTc中,然后转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导,Erns基因获得高效表达。SDS_PAGE分析显示,表达的重组融合蛋白表现分子量约为31ku。Westernblot分析表明,重组蛋白具有良好的免疫原性。重组蛋白可用于制备诊断抗原,用于标记疫苗接种和野毒感染的鉴别诊断。 相似文献
5.
产肠毒素性大肠杆菌K99菌毛蛋白抗原基因的克隆与表达 总被引：4，自引：0，他引：4
应用PCR从产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）中扩增出不含信号肽序列的K99菌毛蛋白基因片段，克隆测序后，将该片段连接到E.coli表达载体pET28a( )中，转化E.coli表达菌株BL21（DE3），筛选得到可诱导表达K99抗原的工程菌株。经IPTG诱导，分离纯化K99重组蛋白，以其免疫新西兰大白兔，获得重组蛋白的兔抗血清；免疫印迹分析表明，此重组蛋白制备的抗血清能与标准的K99强毒株姓明显的抗原抗体反应。 相似文献
6.
猪瘟病毒四川分离株E2基因的分子克隆、原核表达及免疫学活性分析 总被引：2，自引：2，他引：0
分子克隆猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)四川分离株E2基因,并对其进行原核表达及免疫学活性分析。PK-15细胞培养增殖CSFV四川分离株提取总RNA,运用RT-PCR扩增E2基因,定向克隆构建原核重组表达载体,转化E.coli Rosetta-gami-TM(DE3)plysS,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达,Western blotting分析表达蛋白的免疫学活性。试验结果表明,成功克隆了E2基因,共1119 bp,包含有编码E2蛋白的完整序列,编码373个氨基酸;成功构建了CS-FVE2基因完整阅读框、主要抗原区原核表达载体pET-E2(pe)、pET-mE2(pe);蛋白质电泳结果显示,成功表达出约45.32、28.49 ku两目的蛋白,而且表达的E2(pe)、mE2(pe)融合蛋白均能被CSFV阳性血清所识别,具有良好的免疫学反应活性。因此,本试验成功获得CSFV四川分离株E2基因,表达出具有生物学活性的E2(pe)、mE2(pe)融合蛋白。 相似文献
7.
赤羽病病毒N基因硫氧还蛋白融合表达载体的构建与表达 总被引：10，自引：3，他引：7
为获得赤羽病病毒(Akabane virus，AKAV)的核蛋白重组抗原，根据其基因序列(S mRNA)设计合成了1对特异性引物，对AKAV N基因进行RT-PCR扩增，产物大小约为696bp，回收纯化后，将其克隆至pMDl8-T质粒栽体中，经核苷酸序列分析，与已报道的多株AKAV编码核衣壳蛋白N的S mRNA基因比较后发现，所测定毒株的核苷酸序列与TIN毒株的同源性高达98．3％，推测的氨基酸同源性为97．6％，证实为AKAV的N基因。将该基因片段亚克隆插入pBAD／Thio TOPO表达栽体，转化TOPl0细胞，成功地构建了AKAV N基因重组表达栽体。经L-araboinose诱导表达，可稳定、高效地表达AKAV核蛋白抗原。表达蛋白为融合蛋白，分子质量约42．5ku，其表达产量约占茵体总蛋白的28％，融合蛋白中含有AKAV特异性核蛋白抗原，可作为ELISA包被抗原。 相似文献
8.
Trizol法提取猪瘟兔化弱毒株(C株)总RNA,根据GenBank中E0基因序列设计特异性引物,扩增克隆E0基因,插入原核表达载体pET-32a(+),转化进BL2l(DE3)内进行表达。将表达的重组pET-E0蛋白通过His亲和层析柱纯化,以纯化后的蛋白为诊断抗原,包被96孔聚乙烯平板,通过探索抗原包被量和血清稀释倍数,建立检测猪瘟E0抗体的ELISA方法。通过对蛋白表达条件和ELISA反应条件的优化,确定E0蛋白能在BL2l(DE3)内高效表达,表达量达30%,蛋白分子质量约为50 ku,且蛋白以可溶性形式存在。纯化后蛋白浓度为2 mg/mL;抗原最适包被量为300 ng;血清最适稀释度为1∶50。经阻断试验、交叉反应试验和与IDEXX公司猪瘟病毒抗体检测试剂盒的符合性(83%)试验证明,建立的E0-ELISA简便、特异、稳定,为研制开发E2标记疫苗的应用和推广提供配套的检测方法。 相似文献
9.
基于重组猪囊虫18 ku抗原的间接ELISA方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从猪囊尾蚴中克隆到18 ku蛋白基因,将扩增产物与pGEM-T Easy载体连接后测序分析.将目的基因亚克隆至表达载体,构建重组质粒pGEX-CE18,经转化大肠杆菌BL21 (DE3)后诱导表达,用SDS-PAGE和Western-blot分析表达产物.表达的目的蛋白纯化后作抗原建立检测猪囊虫抗体的重组蛋白间接ELISA方法.结果表明,18 ku蛋白基因在大肠杆菌中成功表达,表达产物约为35 ku的融合蛋白,并能被猪囊虫感染血清识别.经薄层扫描分析,表达量占菌体蛋白总量的28%.与商品化ELISA试剂盒平行检测178份阳性血清样品,二者的符合率为98.83%,说明建立的重组蛋白ELISA方法可用于猪囊虫病的诊断. 相似文献
10.
以原构建的克隆载体为模板,PCR扩增梅花鹿FSHα亚基基因,TA克隆后经双酶切插入表达载体pGEX-6P-2,阳性克隆导入E.coli BL21,IPTG诱导表达GST-FSHα融合蛋白,SDS-PAGE进行分析鉴定。结果表明,FSHα PCR产物大小约380 bp,测序结果与GenBank序列一致;重组表达载体pGEX-6P-2-FSHα构建成功;融合蛋白经SDS-PAGE分析,结果发现,在分子质量39.3 ku处出现特异性蛋白质条带,说明梅花鹿FSHα亚基基因片段已在E.coli BL21中成功表达了FSHα-GST融合蛋白。 相似文献
11.
通过RT-PCR方法克隆出GD株Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-1)的结构蛋白VP1基因片段,VP1基因片段和原核表达载体pMAL-C2X均以EcoRⅠ、HindⅢ双酶切后构建获得重组质粒pMAL-C2X-VP1,经限制性酶切和序列测序证明,目的基因正确插入表达载体,转入E.coli BL21(DE3),构建重组表达菌E.coliBL21/pMAL-C2X-VP1,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测结果表明,DHV-1的结构蛋白VP1能在E.coliBL21(DE3)中表达,获得可溶性重组蛋白,表达产物的分子质量约为69ku。 相似文献
12.
新城疫病毒HN基因与T4噬菌体SOC基因在大肠埃希氏菌中的融合表达 总被引：3，自引：1，他引：2
用RT—PCR方法扩增了新城疫病毒(NDV)的完整HN基因序列；设计了1对带有EcoR Ⅰ限制位点的引物，用PCR扩增出了HN基因片段。将该片段克隆至pSOC质粒SOC基因3’端，成功构建了重组质粒pSOC—HN。用该重组质粒转化E．coli BL-21(DE3)感受态细胞，以终浓度1mmol／mL的IPTG诱导表达。在SDS-PAGE凝胶上可检测到分子质量约67ku的特异条带，蛋白质印迹法证实，表达产物与NDV抗血清具有良好的反应性。 相似文献
13.
猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
将猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)基因进行克隆、表达,并获得纯化重组蛋白,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp的功能奠定基础.以RdRp基因cDNA为模板,用PCR扩增出RdRp基因片段,应用定向克隆策略将扩增后片段与高效表达载体pET32a(+)重组,阳性克隆重组质粒经酶切及测序鉴定,IPTG诱导高效表达.PCR法扩增出720 bp的片段,酶切及测序鉴定获得正确的重组质粒,在大肠埃希菌LB21中表达得到分子质量约为46 ku的融合蛋白.成功克隆及表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因. 相似文献
14.
根据GenBank登录的非洲猪瘟病毒(ASFV) VP73基因序列,人工合成VP73主要抗原表位区基因片段,克隆至pUC57载体中.设计1对引物,PCR扩增获得429 bp的VP73基因片段;将VP73基因片段使用EcoRI和SalI酶切后亚克隆至表达载体pGEX-KG,经PCR、酶切、测序鉴定挑选阳性克隆,转化至表达菌株BL21 (DM3)中,进行体外诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析蛋白表达及其活性.结果显示,成功构建表达重组载体pGEX-KG-VP73,对该重组载体进行诱导,有效表达了41 ku重组蛋白,表达量约占菌体总蛋白的17％,Western blot分析证实该蛋白具有良好反应原性. 相似文献
15.
将猪细小病毒分离株LJL12 VP2基因和猪瘟病毒多肽基因E290克隆至真核表达载体pMel Ba-cA,将该重组质粒与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞,并对表达产物进行分析,构建了表达猪瘟病毒T细胞表位和猪细小病毒VP2融合蛋白的重组杆状病毒。结果显示,获得了含VP2基因和E290基因的重组质粒pM-VP2-E290,昆虫细胞sf9的表达产物经SDS-PAGE、Western-blot检测后确定所表达的蛋白质分子质量大小约为67 ku,且具有天然蛋白的抗原特性。免疫电镜观察可见表达产物形成的病毒样颗粒。证实,成功构建了同时含有PPV VP2基因和CSFV特异性T细胞表位基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达。 相似文献
16.
猪瘟病毒贵州流行株E2基因原核表达及其免疫原性的研究 总被引：4，自引：1，他引：3
本研究根据GenBank登录的猪瘟病毒Shimen和C株的E2基因序列设计1对特异引物,采集来自贵州的疑似猪瘟病死猪组织,提取总RNA,进行RT-PCR扩增,将扩增产物测序后进行核苷酸序列比较分析.并将RTPCR产物克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒pMD18-T-E2,经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后,将E2基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,成功构建猪瘟病毒E2基因原核表达质粒pET-32a-E2,将构建好的原核表达质粒pET-32a-E2转化至宿主菌BL21中,诱导表达目的蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳、Western blot分析,得到了约58 ku的条带,与预期大小相符,进一步提取、纯化目的蛋白,将目的蛋白加入弗氏佐剂免疫小鼠,免疫后采血检测抗体,结果显示目的蛋白能诱导小鼠产生一定抗体水平,该研究为猪瘟亚单位疫苗的研究奠定了基础. 相似文献
17.
用RT—PCR方法从河南分离的1株（HN6）猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核酸中扩增缺失N端疏水序列的基因片段dORF5（deleting ORF5），并将其克隆到pMD18-T载体中测序，再亚克隆到原核表达载体pET-32a上。重组质粒转化大肠杆菌BL21，用不同浓度IPTG分别于37℃诱导，经SDS—PAGE分析，所表达的融合蛋白的分子质量约31．4ku，薄层扫描分析显示，表达量占菌体总蛋白含量的28．8％。Western—blotting结果表明，重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。证实，该蛋白可用于PRRSV的诊断。 相似文献
18.
用设计的1对特异性引物对流产布鲁氏菌2型CVCC70502株总DNA进行外膜蛋白基因omp25的PCR扩增，得到了1条完整的基因，大小为642bp；测序分析证明，它与国外报道的流产布鲁氏菌omp25基因的核苷酸序列完全一致。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中，经酶切、PCR扩增和测序分析，表明重组表达载体构建成功。将此重组质粒转化至宿主菌BL21（DE3）中，用IPTG进行诱导。结果证实，该基因可以在大肠杆菌中表达，表达产物为分子质量约50ku的融合蛋白，与理论推测的蛋白分子质量一致；Western—blotting试验证明，表达蛋白OMP25可被流产布鲁氏菌阳性血清所识别。 相似文献
19.
20.
顶复门原虫的AP2结构域蛋白(ApiAP2)可能是调控虫体生长发育的转录因子。本研究旨在克隆、表达毒害艾美耳球虫ApiAP2转录因子，检测其天然蛋白及其在虫体内的亚细胞定位。以毒害艾美耳球虫第3代裂殖子的总RNA为模板，RT-PCR扩增毒害艾美耳球虫EnApiAP2基因后，连接至pMD18-T载体，测序后构建pET28a (+)-EnApiAP2表达载体，转化至表达菌BL21(DE3)，重组菌经测序鉴定后诱导表达，并纯化复性重组蛋白。用重组蛋白免疫BALB/c小鼠，制备鼠抗rEnApiAP2多克隆抗体。利用多克隆抗体，分别用Western blot和间接免疫荧光试验检测裂殖子中天然EnApiAP2蛋白及其定位。最后，应用荧光定量PCR分析EnApiAP2基因在第2、3代裂殖子中的转录水平。结果显示，该基因全长1 830 bp，编码610个氨基酸，含有一个AP2结构域，预测分子质量67.69 ku；重组蛋白大小约为74 ku，主要以包涵体形式存在，可以被6×HIS标签单抗、鸡抗毒害艾美耳球虫康复血清和鸡抗柔嫩艾美耳球虫康复血清识别；在第3代裂殖子中检测到天然EnApiAP2蛋白，分子质量约为85 ku；EnApiAP2蛋白定位在第2、3代裂殖子细胞核内；第3代裂殖子EnApiAP2转录水平显著高于第2代裂殖子(P<0.01)。成功克隆、表达了EnApiAP2基因，证实该基因表达的蛋白定位在裂殖子的细胞核内，为进一步研究EnApiAP2蛋白的转录因子功能奠定了基础。 相似文献