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为了解H11N3亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性，本研究对2020年在福州市某活禽市场鸭中分离的一株H11N3亚型AIV进行了全基因组测序、遗传进化分析和对BALB/c小鼠的致病性试验。测序结果显示，分离株HA裂解位点为PAIASR↓GLF，符合低致病性AIV分子特征；HA蛋白226L和228S突变显示病毒具有结合人源受体(SAα-2,6 Gal)的特征性氨基酸。PB1、PA、NP和M1蛋白均出现对哺乳动物致病性增强的特征性氨基酸。遗传进化分析显示，H11N3 AIV的8个基因节段均属于欧亚分支，其HA基因与A/duck/Fujian/SD061/2017 (H11N3)株HA基因序列相似性最高，而NA基因与A/EN/Fujian/02754/2016 (H3N3)株NA基因序列相似性最高。该病毒内部基因分别与浙江、福建和云南等地鸭和鸡体内分离的H7N9、H7N7、H1N2、H7N2、H7N7和H9N6等亚型AIV相关基因高度同源。小鼠致病性试验结果显示，该病毒未经适应即可在小鼠鼻甲和肺脏中高效复制，表明该病毒株具备感染哺乳动物的能力。上... 相似文献
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《中国兽医学报》2014,(6):874-882
2011—2012年,对我国广西活禽市场进行流行病学监测时从麻雀体内分离鉴定出1株H1亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/Sparrow/Guangxi/GXs-1/2012(H1N2)。为了解该株H1亚型AIV的来源、特征及其分子演化规律,本研究对其全基因序列进行测定,并与GenBank登录的相关病毒进行遗传演化分析。结果表明:这株分离纯化的H1N2毒株HA基因切割位点附近的氨基酸序列为PSIQSR↓GLF,属于低致病力AIV的特征;NA基因与A/duck/Guangxi/GXd-2/2010(H6N2)在同一分支内,核苷酸同源性为98%;PB1与PB2基因与H5和H4亚型较为接近;PA基因与A/duck/Guangdong/E1/2012(H10N8)同源性最高;NP基因则与A/chicken/Pakistan/NARC-16945/2010(H3N1)同源性达97%;而NS与MP基因分别与A/wild duck/Korea/SH5-26/2008(H4N6)、A/duck/Shanghai/C84/2009(H3N2)同源性最高。因此,推测A/Sparrow/Guangxi/GXs-1/2012(H1N2)可能是不同来源的基因经过复杂重组演变后的1株重组病毒。 相似文献
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为研究一株天鹅源H5N8亚型禽流感病毒(AIV)的遗传演化规律,本研究对2016年从山西省疾控中心送检天鹅样品中分离到的一株H5N8亚型流感病毒(A/swan/Shanxi/6/2016)的全基因组序列进行高通量测序及遗传演化分析。结果显示,分离的病毒为Clade 2.3.4.4分支高致病禽流感病毒(HPAIV);BLAST分析显示该分离株的NP基因与H3N8亚型AIV的NP基因具有较高同源性,而其它基因节段则分别与来自其它国家的H5N8亚型AIV的相应基因节段同源性较高,进一步选取与各基因节段核苷酸同源性较高的病毒株作参考序列构建其系统进化树,推测该分离株为一株重组病毒株。特殊氨基酸位点分析显示,其具有典型的禽型受体结合位点和典型的人型受体结合位点。并且M1蛋白、NS1蛋白和PB2蛋白具有H5N1亚型AIV对鼠致病性增强的分子标志,提示该株野鸟源流感病毒可能具备感染哺乳动物的能力。本研究对H5N8亚型AIV的综合防控具有一定的指导意义。 相似文献
4.
2021年本实验室从发病野鸟组织样品中分离到一株H5N8亚型禽流感病毒(AIV)，命名为A/black-headed gull/Tibet/1-2/2021(H5N8)，简称为BH Gull/TB/1-2/2021(H5N8)。为进一步了解该病毒的生物学特性，本研究对其基因组测序并经遗传演化分析，结果显示，该病毒HA蛋白的裂解位点为PLREKRRKR↓GLF，符合高致病性AIV(HPAIV)的分子特征。在遗传进化上HA基因属于2.3.4.4b分支，外部基因与部分内部基因(PB1、PA、NP、NS)均与2020年～2021年分离到的H5N8亚型AIV相应基因的同源性最高，且处于同一分支；PB2基因与一株H9N2亚型AIV PB2基因同源性最高，为99.25%;M基因与近两年流行的2.3.4.4b分支H5N1亚型AIV同源性最高，且处于同一分支，推测该病毒为一株重组病毒。抗原性分析结果显示，该病毒与2.3.4.4分支H5-Re8、2.3.4.4b分支H5-Re14疫苗株抗原性相近。不同哺乳动物细胞系生长曲线结果显示，该病毒可在哺乳动物细胞系中有效复制，但其在A549中的复制效率高于其在MD... 相似文献
5.
采用RT-PCR扩增了国内H7N2禽流感病毒(AIV)CK/HB/1/02分离株的完整神经氨酸酶(NA)基因节段,测定了其核苷酸序列,并与GenBank中AIV NA基因序列进行了同源性比较和氨基酸编码分析,绘制了NA基因的系统发育进化树。结果表明,AIVCK/HB/1/02分离株NA基因的完整序列长度为1467bp,包括5′-末端和3′-末端的非编码区,其最大阅读框(ORF)编码469个氨基酸,第61~65位氨基酸序列为-NITGI-,不同于国内H9N2AIV的特殊遗传标记。该病毒NA基因的核苷酸序列与GenBank中人类流感病毒A/Leningrad/134/57(H2N2)的NA基因同源性最高,为93.3%;其次为香港的鸭源、人源、猪源H3N2病毒(89%~93%);而与我国北京、广东、香港和韩国的H9N2AIV以及美国的H7N2AIV的同源性较低(85%~88%)。在N2基因系统发育进化树中,CK/HB/1/02分离株处于欧亚分支内,与H2N2人流感病毒的亲缘关系较近;与北美H7N2AIV处在不同分支,遗传距离较远。 相似文献
6.
快速检测和鉴定禽流感病毒(AIV)亚型对该病的防控具有重要意义。参考文献报道设计合成引物,采用二步RT-PCR方法,从H5/H7亚型AIV血凝抑制抗原和H9鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,建立禽流感病毒通用、H5/H7/H9亚型和N1-N9亚型鉴定方法。结果表明:针对AIV基质蛋白基因(M)和核蛋白基因(NP)的通用检测方法能有效扩增出目的条带;鉴别H5/H7/H9亚型的复合PCR扩增结果与预期目标一致;鉴别N1-N9亚型PCR方法扩增出N1/N2/N6/N9亚型目的条带;与其他4种常见病原无交叉反应。初步应用该方法检测样品,证明该方法对禽流感快速诊断和亚型鉴定具有潜在的应用价值。 相似文献
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为建立简便快速检测禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)并同时区分出H9、N2亚型的方法,本试验根据基因库中H9亚型AIV的HA基因、N2亚型AIV的NA基因及AIV的M基因序列,分别设计了3对针对这3种基因保守序列的引物,建立了AIV H9N2亚型的三重PCR检测方法。应用该方法对H9N2亚型AIV模板进行PCR扩增,可得到3条与试验设计相符的目的条带,分别为313 bp (HA基因)、451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9亚型的N2亚型AIV模板进行扩增,出现2条特异性扩增条带,即451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9、N2亚型AIV模板进行扩增则只出现一条目的条带,即667 bp(M基因);对其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。敏感性试验结果显示此三重PCR方法最低检出限为10-2 ng/μL。应用所建立的三重PCR方法对120份临床病料进行检测的结果与病毒分离鉴定结果一致。各项试验结果均表明,该方法对于禽流感病毒尤其是H9、N2亚型禽流感病毒的检测具有快捷、特异、灵敏的特点。 相似文献
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扩增、克隆H6N1亚型禽流感病毒(AIV) A/ mallard/ Sanjiang/275/2007(M-275)的全基因序列,进行序列分析,并探讨该病毒的进化特点.设计特异性引物,扩增克隆2007年从三江自然保护区野鸭身上分离到的H6N1亚型AIV,测序后进行序列分析.同源性分析发现,M-275与H6亚型和N1亚型AIV同源性最高,说明M-275为H6N1亚型.其裂解位点为PQIETR↓G,无连续碱性氨基酸的插入,说明M-275属于典型的低致病性毒株.通过序列比对,M-275的HA基因与2000年以后北美以及中国地区分离到的H6亚型AIV同源性在97％以上,与HA基因同源性最高的毒株为A/northern pintail/Alaska/44202-143/2006 (H6N1)和A/northern pintail/Alaska/44204-158/2006(H6N4),与NA基因的核苷酸同源性最高的毒株是A/mallard/ON/499/2005(H5N1),推测M-275的NA基因片段来自于该病毒谱系.进化分析结果显示,HA基因与美国、日本、中国等国家和地区流行的N1、H2、N4、N8和N9等亚型毒株处于同一分支;NA基因与美国、日本等国家和地区流行的H2、H5、H6、H11、H3等亚型毒株处于同一分支;PB1基因与美国、日本等国家和地区流行的毒株处于同一分支;而PB2、NP、M以及NS基因则与日本、韩国、香港和中国地区的病毒株处于同一分支;PA同中国地区和澳大利亚、马来西亚、瑞典等国家的毒株处于同一分支.M-275毒株基因组构成来源复杂,NA基因和NP基因分别与野鸭源的H5N1和HIN1等毒株同源性很高,表明H6亚型禽流感病毒也在不断的发生重排,值得深入研究. 相似文献
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为了解H5N3亚型流感病毒的生物学特性,本研究对2017年浙江省分离到的一株H5N3亚型禽流感病毒(AIV)[DK/ZJ/S1368/2017(H5N3)]进行了遗传演化分析及小鼠感染性实验。遗传演化分析结果显示,该株病毒的HA蛋白裂解位点处仅含一个碱性氨基酸,属于低致病性AIV。同时,该病毒的血凝素(HA)基因与H5N7亚型流感病毒亲缘关系较近;聚合酶碱性蛋白2(PB2)基因和核蛋白(NP)基因与H10N7亚型流感病毒亲缘关系较近;碱性聚合酶蛋白1(PB1)基因与H1N1亚型流感病毒亲缘关系较近;酸性聚合酶蛋白(PA)基因与H6N2亚型流感病毒亲缘关系较近;神经氨酸酶(NA)基因与H10N3亚型流感病毒亲缘关系较近;基质蛋白(M)基因与H3N8亚型流感病毒亲缘关系较近;非结构蛋白(NS)基因与H1N1亚型流感病毒亲缘关系较近。表明其基因来源复杂。小鼠感染实验结果显示,该分离株无需提前适应即可以在小鼠肺脏和鼻甲中复制,小鼠感染病毒后无明显临床症状,与对照组相比其体质量变化不明显,表明该病毒对小鼠呈低致病性。本研究通过对该H5N3亚型AIV的生物学特性的分析,发现该病毒基因来源复杂,无需提前适应就可以在小鼠体内复制,具有感染哺乳动物的潜在威胁,提示应当持续加强对H5N3亚型AIV的监测和相关生物学特性的研究工作。 相似文献
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2022年8月,青海省刚察县野鸭出现异常死亡。采集死亡野鸭的组织提取核酸,经禽流感病毒(AIV)M基因引物初步鉴定定样品中含有AIV,随后H5/H7/H9分型引物鉴定。进一步二代测序后获得了AIV的8片段基因序列。序列比对分析表明,除了NS基因,其余基因与以往报道或H5亚型AIV标准毒株的内部基因同源性较高,HA基因裂解位点具有高致病性(HPAI)AIV的特征,故将感染野鸭的毒株命名为A/Wigeon/Qinghai/2022(H5N1)。从HA基因的遗传进化分析中发现,A/Wigeon/Qinghai/2022(H5N1)与最近几年在野鸟中流行的H5N1和H5N8同在2.3.4.4b分支,而与2005—2015年在青海湖地区流行的毒株遗传距离较远,表明青海湖野鸟源H5亚型AIV遗传多样性丰富,需要持续对该地区野鸟中携带的AIV进行监测。 相似文献
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将本实验室分离保存、已经过PCR扩增、核酸测序鉴定的三种不同亚型禽流感病毒(AIVH5N1、H6N2、H9N2)分别接种鸡胚,收集尿囊液,分离提取AIV总RNA。参考H1￣H15亚型禽流感病毒的核蛋白(NP)基因序列以及H5、H6、H9亚型AIV血凝素(HA)基因序列,设计四对引物:NP1,NP2;H5P1,H5P2;H6P1,H6P2;H9P1,H9P2,混合为PCR扩增多重引物MP1,下游引物NP2、H5P2、H6P2,、H9P2混合为逆转录反应多重引物MP2。AIV总RNA在相同反应条件下经MP2逆转录,用MP1进行PCR扩增,AIVH5亚型材料得到205bp,563bp两条扩增带,AIVH6亚型材料得到205bp,233bp两条扩增带,AIVH9亚型材料得到205bp,690bp两条扩增带,都与实验设计相符合,阴性材料没有扩增带。该方法成功实现四对引物进行RT-PCR反应同时检测出AIV,准确诊断H5、H6、H9三种禽流感亚型,检测时间短,特异性强,能及时检测出AIV亚型。 相似文献
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为建立H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）免疫层析快速检测技术,本研究以差速离心法纯化H9N2亚型AIV免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合和HAT选择性培养;以H9N2亚型AIV感染MDCK细胞建立异源免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）的单克隆抗体检测方法,通过对杂交瘤细胞的IPMA筛选和连续克隆化筛选鉴定抗H9N2亚型AIV中和性单克隆抗体;以胶体金标记HA单克隆抗体,配对HA单克隆抗体和羊抗小鼠IgG为检测线和质控线,制备H9N2亚型AIV快速检测试纸条,测定其特异性和敏感性。结果显示,获得了11株稳定分泌抗H9N2亚型AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞,其单克隆抗体腹水IPMA效价在1.28×10-4至2.56×10-5之间。单克隆抗体3A2、5H6、6B8、7E10和9G12血凝抑制试验（HI）显示血凝抑制活性,其（HI）效价在6log2~9log2之间。单克隆抗体3A2、6B8和9G12在病毒中和试验中对H9N2亚型AIV有显著病毒中和活性,中和效价分别1∶6 400、1∶25 600和1∶25 600。Western blotting结果提示,该中和单克隆抗体识别HA蛋白线性抗原表位。利用配对单克隆抗体3A2和9G12研制的H9N2亚型AIV检测试纸条检测H9N2亚型AIV尿囊液的效价为9log2,灵敏度与经典血凝试验（HA）相当,与其他亚型AIV （H1、H3、H5、H7）,以及新城疫病毒和鸡传染性法氏囊病病毒等相关病毒均无交叉反应。本研究制备了具有病毒中和活性的抗H9N2亚型AIV单克隆抗体,并初步研制了H9N2亚型AIV检测试纸条,为H9N2亚型AIV新型疫苗研制和快速检测奠定良好的研究基础。 相似文献
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In order to develop a rapid and simultaneous assay for H7N9 subtype avian influenza virus （AIV）, three pairs of specific primers were designed according to the conserved sequences of the hemagglutinin (HA) gene of H7 subtype AIV, the neuramidinase (NA) gene of N9 subtype AIV, and the matix (M) gene of all subtypes AIV. The reaction conditions were optimized, and the specificity and sensitivity of this method were evaluated to develop a triplex PCR assay. It was shown that H7N9 subtype AIV could be amplified into three specific bands by this triplex PCR, the lengths of these bands were 330 (H7 AIV), 207 (N9 AIV) and 632 bp (all AIV), respectively. Samples containing H7 or N9 subtype AIV could be amplified into two specific bands, which were 330 and 632, 207 and 632 bp, respectively. Samples containing other subtypes AIV could be amplified into a 632 bp specific band. No specific band was amplified from other avian pathogenic virus. Sensitivity test results showed that as low as 103 copies/μL H7N9 subtype AIV could be detected. This triplex PCR could simultaneously diagnose H7N9 subtype AIV, single H7 subtype AIV, single N9 subtype AIV and other subtype AIV in one tube. This assay was a rapid, specific and sensitive method for the detection of H7N9 subtype AIV. It could be applied in rapid diagnosis for clinical samples, and also provided a technical support to prevent and control H7N9 subtype AIV. 相似文献
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2008年国家禽流感参考实验室在我国禽流感流行病学调查期间分离到1株鸡源H6N1亚型禽流感病毒(AIV)A/Chicken/ZheJiang/80/2008(H6N1)(简称为CK/ZJ/80/08),为了弄清该病毒的分子特征,我们对其8个基因片段分别进行扩增和序列测定,对每个基因进行BLAST分析,找出同源性最高的毒株。利用DNAStar中的Megalign功能进行进化分析。结果表明CK/ZJ/80/08的HA裂解位点附近的氨基酸序列为QIETR↓GLF,推测可能为一株低致病力AIV。其HA基因与日本北海道的A/duck/Hokkaido/228/2003(H6N8)和黑龙江的A/mallard/Heilongjiang/131/2006(H6N2)以及香港早期分离株A/chicken/HongKong/17/77(H6N1)等处于同一分支;NA基因在颈部没有缺失,与A/duck/Tsukuba/718/2005(H1N1)、A/goose/Guangdong/1/96(H5N1)等处于同一分支;M基因与A/duck/Hokkaido/W90/2007(H10N7)高度同源(同源性为99%);NS基因与A/duck/Denmark/65047/04(H5N2)和A/goose/Guangdong/1/96(H5N1)处于同一分支。NP、PA、PB1、PB2分别与贵州和江西分离的H5N2亚型AIV的相应基因关系密切,同源性分别为98%、97%、97%、97%。由此推测CK/ZJ/80/08可能是由H6N2、H1N1、H10N7、H5N2等多个亚型病毒重组而成。 相似文献
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H9N2亚型禽流感病毒(AIV)在自然界中广泛存在和传播,给养禽业造成了巨大损失。为了进一步揭示该病毒的致病机制,本研究采用RT-PCR技术扩增禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/1/2006(简称SH1)的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS 8个基因片段,并分别克隆至PLLB双向表达载体上。采用8质粒系统共转染293T细胞,转染48 h后加入TPCK胰酶作用2 h,将上清液和细胞一同接种9~11日龄SPF鸡胚,并检测其血凝效价。经序列比对,拯救获得的病毒rSH1的8个基因片段序列均与亲本病毒SH1的序列相同。实验结果表明,本研究成功建立了H9N2亚型禽流感病毒反向遗传操作系统,为该病毒的致病机理和传播机制研究等奠定了技术平台。 相似文献
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为探讨海藻硫酸多糖（sulfated polysaccharide from algae,SPA）及中药复方提取液（compound extracts of Chinese medicine,CECM）对H9N2亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）的作用,将SPA及CECM以3种不同加药方式作用于接种了H9N2亚型AIV的10日龄SPF鸡胚中,无菌收集鸡胚尿囊液,测定血凝效价,检测2种药液对H9N2亚型AIV的预防、治疗及直接灭活作用。结果显示,SPA及CECM的最大安全浓度分别为50和200 mg/mL;3种不同加药方式下,不同浓度SPA及CECM均能极显著降低鸡胚尿囊液中H9N2亚型AIV的血凝效价（P<0.01）,以直接灭活作用组的血凝效价降低幅度最大,预防作用组和治疗作用组次之。预防作用组,CECM高剂量组（200 mg/mL）的抗病毒效果显著优于SPA各剂量组（12.5、25和50 mg/mL）及CECM低、中剂量组（50和100 mg/mL）（P<0.05）;治疗作用组,SPA高剂量组（50 mg/mL）及CECM中、高剂量组（100和200 mg/mL）抗病毒效果显著优于SPA低剂量组（12.5 mg/mL）（P<0.05）;直接灭活作用组,SPA及CECM的抗病毒效果均佳,CECM各剂量组的抗病毒效果与SPA各剂量组差异极显著（P<0.01）。结果表明,SPA和CECM对10日龄鸡胚几乎无毒副作用;SPA及CECM均能显著抑制H9N2亚型AIV在鸡胚尿囊液中的增殖,以直接灭活作用组的抗病毒效果最佳,其抗H9N2亚型AIV作用的强弱与药物浓度、用药和病毒的感染时间顺序密切相关。 相似文献
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为实现H9N2亚型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）疫苗上下游过程的控制，本研究结合蔗糖密度梯度离心和SDS-PAGE灰度分析建立了H9N2亚型AIV纯化和病毒HA蛋白定量的方法。首先将收获的病毒原液经差速离心、PEG6000沉淀和蔗糖密度梯度离心分别进行澄清、浓缩和分离纯化；其次，采用改装过的高效液相色谱仪系统（HPLC）准确定位和收集病毒离心区带，并对该区带进行SDS-PAGE和Western blotting分析，同时考察该收集方式的线性和重复性；然后，在此基础上优化病毒液的澄清工艺以提高病毒回收率；最后，观察还原SDS-PAGE分离的H9N2亚型AIV蛋白条带的共迁移情况并确定糖苷酶PNGase F脱糖基处理的最佳条件，采用Image J软件分析SDS-PAGE图谱中4个主要病毒蛋白条带（NP、HA1、M1和HA2）的灰度以确定流感病毒血凝素的含量。结果表明，HPLC收集的病毒离心区带的蛋白浓度与PEG6000浓缩的上清体积在8~32 mL范围内具有良好的线性关系（R2=0.994），且该收集方式重复性好，批内和批间变异系数分别为1.29%和4.11%。病毒液经过澄清、浓缩和分离纯化后，最终的病毒回收率为79.55%。纯化的H9N2亚型AIV的蛋白浓度为1 000 μg/mL时，经糖苷酶PNGase F脱糖基处理后便能得到条带清晰平整且分离良好的SDS-PAGE图谱。经灰度分析，HA含量占总病毒蛋白含量的46.18%。本研究初步建立了H9N2亚型AIV纯化和病毒HA蛋白定量的方法，为H9N2亚型AIV全病毒灭活疫苗的研发和生产提供了简单、准确的检测手段。 相似文献
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H9亚型禽流感在我国家禽中广泛流行,给养禽业造成巨大经济损失的同时,也严重威胁着公共卫生安全。H9亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）具有高度遗传变异性,导致流行株和疫苗株之间抗原匹配性差,从而影响疫苗的临床保护效果,急需研发一种高效、具有交叉保护性的通用型H9亚型禽流感疫苗。马赛克疫苗是针对遗传多样性病原体设计,通过整合所有抗原序列获得一条抗原表位覆盖最广泛的嵌合蛋白,并制备疫苗。本研究参考mosaic疫苗设计原则,设计、优化并合成了一条H9亚型禽流感病毒的mosaic血凝素（hemagglutinin,HA）基因序列,采用反向遗传操作技术,以H1N1亚型流感病毒PR8株为骨架,以mosaic H9HA序列替换PR8株的HA片段,获得重组病毒rPR8-HAm/H9。将其制备为灭活疫苗并免疫SPF雏鸡,监测抗体水平、攻毒保护效果,评价其交叉保护效果。结果表明,重组病毒rPR8-HAm/H9灭活疫苗免疫SPF雏鸡,可诱导机体产生较高水平的HI抗体和中和抗体,可显著抑制攻毒后病毒的脱落,对H9N2 AIV JM0305株的攻毒保护率为80%。rPR8-HAm/H9灭活疫苗可以对异源H9N2 AIV JM0305株产生较好的交叉攻毒保护,为研发基于马赛克技术的禽流感通用疫苗提供了前期基础。 相似文献