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1.
将新城疫病毒（NDV）F48E9株的F和HN基因克隆到真核细胞表达载体pCAGG上,经酶切、PCR鉴定和序列分析,筛选出含有F和HN基因的重组质粒,命名为pCAGG-F和pCAGG-HN。纯化的质粒转染Vero细胞后,经间接免疫荧光试验检测到蛋白的表达。pCAGG-F和pCAGG-HN重组质粒共转染Vero细胞后,观察到明显的细胞融合现象。结果表明NDV F48E9株的F和HN蛋白在真核细胞内得到了真实的表达,并且表达产物具有天然蛋白活性。 相似文献
2.
新城疫病毒F基因在大肠杆菌中的高效表达及其免疫原性分析 总被引：2，自引：0，他引：2
应用PCR技术,以含有新城疫病毒F48E8株全长融合蛋白(F)基因的真核表达质粒pVAX1-F为模板,扩增出594bp大小的F基因的部分片段.经克隆筛选和测序后,构建成重组原核表达质粒pGEX-6P-1-F.重组质粒转化表达菌BL21,获得重组菌BL21(pGEX-6P-1-F).经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表明,F基因在原核表达体系中获得高效表达,表达量占菌体总蛋白的23%.Western blotting结果显示,在相对分子质量46 ku位置有特异性条带.动物实验结果表明,F蛋白免疫鸡产生的针对新城疫病毒F蛋白的血清抗体效价显著高于空白对照组(P＜0.05),说明原核表达系统表达的F蛋白具有良好的免疫原性. 相似文献
3.
为了快速、敏感、特异地鉴别区分新城疫强、弱毒株,根据新城疫病毒F基因序列设计出并合成两对特异性引物,XsXq、XrXa,用来区分新城疫强毒株和弱毒株,其中XsXa可组合用来扩增新城疫所有毒株,利用这三对引物对新城疫病毒的F基因片段进行多联RT—PCR扩增,并对该多联RT—PCR检-测方法进行敏感性及特异性试验。结果表明：这三对引物能特异性地扩增出新城疫强、弱毒株及NDV毒株的F基因片段,大小分别为259bpNDV（F48E9）、522bpNDV（LaSota）、757bp（NDV）,该检测方法敏感性高,特异性强,初步建立起快速、敏感、特异的鉴别诊断新城疫强、弱毒株的分子诊断方法。 相似文献
4.
根据发表的鹅副粘病毒SF02株全基因组序列,分别设计合成一对引物和二对引物,分别采用RT-PCR方法和RT-套式PCR扩增出与预期设计大小相符的F基因和HN基因特异性条带.将扩增出的DNA片段克隆到pMD18-T载体中,转化TGI感受态细胞,经AMP/IPTG/X-Gal平板筛选,酶切鉴定,获得阳性重组质粒.对重组质粒进行序列测定,结果表明:鹅副粘病毒JS/1/97/Go株F基因全长1662bp,编码553个氨基酸残基;F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,与NDV的强毒株特征相符.HN基因全长1716bp,编码571个氨基酸残基.将F基因插入到原核表达质粒pGEX-6P-1的EcoR Ⅰ、Xho I多克隆位点之间,转化到TGI感受态细胞中,获得了表达F基因的阳性亚克隆重组质粒;将HN堪因插入原核表达质粒pProEX HTb的XBaⅠ、XhoⅠ多克隆位点之间,转化到TGI感受态细胞中,获得了表达HN基因的阳性亚克隆重组质粒. 相似文献
5.
构建新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, NP)基因的原核表达载体,并将其在宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中表达。以NDV La Sota株NP基因序列为模板,设计特异性引物,通过PCR扩增获得NP蛋白全长基因片段,定向插入原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET-NDV NP;将构建的重组质粒转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,表达出目的蛋白,并采用亲和层析的方法纯化表达蛋白;表达蛋白采用Western blotting方法检测其反应原性。结果显示,成功克隆了新城疫病毒NP基因全长,片段序列1470 bp;构建的pET-NDV NP载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误;转化表达宿主菌后经SDS-PAGE检测结果显示目的基因得到成功表达,且表达蛋白经Ni-NTA镍离子亲和层析法被成功纯化,蛋白质浓度为3 mg/mL;Western blotting检测结果显示表达蛋白具有良好的反应原性。试验结果表明,成功构建了含有新城疫病毒核衣壳蛋白基因的原核表达载体,成功表达、纯化得到了NDV NP蛋白。 相似文献
6.
根据新城疫病毒（NDV）F48E9国内标准强毒株编码序列设计了2对特异性引物,分别用于扩增M和NP基因。经序列测定,将其克隆到原核表达载体pET-30a（＋）上,转化E．coliBL21（DE3）,筛选表达NDVF48E9株M蛋白和NP蛋白的菌株。IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析结果表明,NDVM蛋白在E．coliBL21（DE3）内以可溶形式存在,而NP蛋白以包涵体的形式表达。用纯化的M和NP蛋白免疫鸡制备超免疫血清,进行Western-blot分析;结果,它们可以与真核表达系统表达的M和NP蛋白以及NDV发生特异性反应,表明,原核表达系统表达的NDVM和NP蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。 相似文献
7.
根据已发表的分离自麻鸡的新城疫病毒SX-1株F基因序列,采用PCR体外定点突变技术,设计2对引物,引物中含有突变位点.应用重叠PCR延伸法,分3次PCR扩增F基因,从而得到突变后的F基因,命名为F基因,使改造后的F基因编码的氨基酸裂解位点为112GlyArg-Gin-Gly-Arg-Leu117.在EeoR Ⅰ和Hind Ⅲ位点将F基因与转座载体pFastBac Ⅰ连接,获得重组质粒,并进行PCR、酶切鉴定,核苷酸序列测定正确的pFastBac-F'质粒转化到DH10Bac宿主茵,将目的基因定向插入到Bacmid质粒中,经筛选获得的重组Bacmid F'质粒转染Sf-9昆虫细胞,并进行表达检测,表达产物间接免疫荧光试验阳性,经SDS-PAGE、Western-blotting检测显示,获得分子量约63 ku的蛋白特异条带,说明F'重组蛋白表达成功. 相似文献
8.
为在昆虫细胞中表达鸭源新城疫病毒(NDV) F蛋白,本试验首先根据鸭源NDV F基因序列设计引物,PCR扩增出F基因,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1,获得重组转座载体pFastBac-F,将其转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-F,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-F。Western blotting、间接免疫荧光试验结果均显示表达的重组蛋白能与鸭抗NDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。结果表明鸭源NDV F蛋白在昆虫细胞中获得了成功表达,为鸭新城疫的预防控制奠定了基础。 相似文献
9.
【目的】 设计构建分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞, 并评估表达的E2-GM-CSF融合蛋白的免疫原性, 为猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)的防控提供新的候选亚单位疫苗。【方法】 利用PCR方法扩增E2-GM-CSF基因并克隆入慢病毒表达载体pCDH, 将得到的重组慢病毒质粒pCDH-E2-GM-CSF包装成E2-GM-CSF慢病毒颗粒, 转导HEK293T细胞, 经嘌呤霉素加压筛选获得分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞, 纯化表达的E2-GM-CSF融合蛋白经小鼠免疫试验验证其免疫原性。【结果】 pCDH-E2-GM-CSF质粒经酶切鉴定, 得到大小分别为8 172 bp的载体片段和1 521 bp的E2-GM-CSF基因片段, 表明E2-GM-CSF基因成功克隆入pCDH载体; 细胞基因组DNA PCR扩增结果为一条大小为1 686 bp的条带, 表明E2-GM-CSF基因成功整合至HEK293T细胞基因组; Western blotting分析获得约70 ku的条带, 证明E2-GM-CSF融合蛋白在HEK293T细胞中成功分泌表达; SDS-PAGE验证显示, 纯化后的E2-GM-CSF融合蛋白为单一条带, 纯度较高, 大小约70 ku; 小鼠免疫血清ELISA检测结果表明, 表达的E2-GM-CSF融合蛋白具有良好的免疫原性, 免疫后第14天在小鼠血清中检测到效价为1∶300的E2特异性抗体, 免疫后第21天E2特异性抗体效价达1∶900, 免疫后第28天小鼠血清中的E2特异性抗体效价最高达到1∶8 100, 远高于E2蛋白的1∶1 800。【结论】 利用慢病毒载体构建的表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞可正确分泌表达具有免疫原性的E2-GM-CSF融合蛋白, 为CSFV的防控提供了新的候选亚单位疫苗, 同时其构建、开发与评估过程也可为其他亚单位疫苗在哺乳动物细胞中的快速表达提供借鉴。 相似文献
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应用RT-PCR对新城疫病毒分离株毒力的快速鉴定 总被引：4，自引：3，他引：1
根据新城疫病毒 (NDV)强、弱毒株在 F蛋白裂解位点氨基酸组成和序列上的差异 ,参照有关文献 ,设计了 3对引物 (A B,A C,A D)。引物 A B能从 L a Sota、B1 、 系和强毒 F4 8E8的含毒尿囊液中扩增出 36 2 bp的核酸片段 ,引物 A C仅能从强毒 F4 8E8的含毒尿囊液中扩增出 2 5 4 bp的片段 ,引物 A D仅能从 L a Sota、B1 、 系的含毒尿囊液中扩增出 2 5 4 bp片段。 3对引物均不能从 IB、IBD、AI的含毒尿囊液和正常鸡胚尿囊液中扩增出特异片段。从发病鸡群中分离的 3株 NDV毒株均被 A C引物扩出 ,它们的鸡胚平均死亡时间 (MDT)分别为 5 1.8、5 3.2、5 2 .6 h,1日龄雏鸡脑内接种指数 (ICPI)为 1.6 5、1.6 3、1.6 0 ,证明是 NDV强毒。利用 RT- PCR对 NDV人工感染鸡最早可于攻毒后第 2天从病鸡气管中检测到 NDV,其次为泄殖腔和脾、肾。利用 RT- PCR对 NDV毒力的鉴定结果与传统生物学试验的测定结果完全吻合 ,但前者可在 2 4 h内直接对组织匀浆进行诊断 ,具有快速、简便和敏感的特点 相似文献
11.
ＤＤＲＴ－ＰＣＲ技术用于寻找小鼠印迹基因的原理,主要通过观察小鼠亲本及它们杂交后代等位基因的多态表达,就能清楚区分基因的母源表达与父源表达,从而筛选出印迹基因。本研究通过ＤＤＲＴ－ＰＣＲ技术克隆到了一个新的印迹基因,并对其染色体定位,基因结构和表达等特性进行了初步研究。 相似文献
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14.
The presence of the pseudorabies virus (PRV) genome in infected hosts has previously been studied by standard hybridization techniques, which showed the viral genome to be present at very low levels in infected tissues. The recently introduced polymerase chain reaction (PCR) procedure provides an alternative and rapid means of amplifying small quantities of specific DNA sequences. We applied this technique to a study of pigs infected by PRV. The sequence selected for amplification consisted of 222 base pairs lying in the gene coding for the glycoprotein gp50. We used a pair of 20-mer oligonucleotides flanking this sequence as primer and a cloned Stu-Nde fragment containing the sequence as target DNA. To avoid the tedious DNA extraction procedure we performed PCR directly on disrupted cells and detected specific amplification after 25 cycles of PCR with the thermostable Taq DNA polymerase. Amplified products were detected by gel electrophoresis directly. Nasal samples from experimentally and naturally infected pigs were tested by this PCR technique. When compared with tissue culture and serological tests, detection by gel electrophoresis of PCR amplified fragments provided excellent specificity and sensitivity. We concluded that PCR amplification will be a valuable tool for rapid diagnosis of PRV infection in pigs, taking less than 1 h to complete. 相似文献
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采用一种类似PCR的基因组自我引发PCR(GSP PRC)法 ,初步研究了家蚕、野桑蚕、天蚕、蓖麻蚕和柞蚕的微卫星DNA的体外基因组自我引发PCR扩增条件。质量浓度为 10 0mg/L的基因组DNA经 10 0℃变性 15min后 ,与等量相同浓度未变性的DNA混合作为模板 ,在 80 μL扩增体系 [含 0 2mmol/LdNTPs、5 0mmol/LKCl、10mmol/LTris HCl(pH 9 0 )、4mmol/LMgCl2 、1 2 5UTaqpolymerase]中加入 1μL此混合模板 ,在92℃、1min→ 5 5℃、2min→72℃、2min ,30～ 90次累积循环的扩增条件下 ,成功地得到了PCR产物。反应体系中 ,基因组DNA的适宜质量浓度为 1 2 5mg/L。GSP PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后的部分片段回收后 ,在同样条件下 ,30～ 6 0个循环可得到同样大小范围的产物。GSP PCR产物经 6 %的变性测序胶电泳 ,得到典型的梯状带 ,表明为微卫星DNA。 相似文献
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Yamano Y Ohyama K Ohta M Nakamura J Morishima I 《The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science》2005,67(11):1181-1184
In this study, we cloned a cDNA that encodes a small heat shock protein, Hsp20 (alphaB crystallin-related protein), from a maturing rat testis by means of differential display. The full-length cDNA sequence was completely identical to that registered in the DNA databank. The expression of Hsp20 gene was detected strongly in the heart and slightly in the testis of a 9-week-old rat. The expression of Hsp20 increased gradually from three weeks to 9 weeks, and the strongest expression was observed in the testis at week fifteen. The expression was localized in spermatocytes and round spermatids. The gene expression was not affected by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) when it was administered into male rats during the nursling period. 相似文献
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The aim of the present study is to identify ostrich sex by using polymerase chain reaction (PCR) on micro amounts of DNA from blood, bloodstain and feathers. Sixteen male and 18 female ostriches were used as test individuals. Genomic DNA as a template was extracted by the Chelex method. Ostrsex‐P1 and P2 primers were designed to perform PCR amplification on the template. PCR products were checked using agarose gel electrophoresis with ethidium bromide staining and ostrich sex was determined directly by the bands shown on the gel. The results demonstrate that ostrich sex can be determined by the extraction of DNA from as little as 0.0125 μl blood using Chelex, whereby the use of large amounts of organic solvents such as phenol and chloroform are unnecessary. In addition, it is possible to identify ostrich sex using micro amounts of DNA extracted from bloodstains and/or feathers. The use of feathers particularly avoids unwanted sampling problems such as the difficulty of collecting ostrich blood, the stress to the ostrich caused by bleeding, and the demand for a lot of manpower for ostrich restraint. 相似文献
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减蛋综合征病毒末端片段的克隆及细胞内DNA重组 总被引：6，自引：0，他引：6
采用９～１０日龄非免疫鸭胚增殖的减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）ＡＡ－２毒株,经差速离心法浓缩纯化后,提取病毒基因组ＤＮＡ。采用碱变性法除去病毒基因组共价结合的末端蛋白（ＴＰ）。用限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ水解纯化的ＥＤＳＶ基因组ＤＮＡ。经低熔点琼脂糖凝胶电泳后,回收Ｃ、Ｄ、Ｅ片段。克隆到ｐＵＣ１９载体的ＨｉｎｄⅢ和ＳｍａⅠ双酶切位点及ＨｉｎｄⅢ位点上,经蓝白斑筛选和单、双酶切鉴定,获得了ｐＵＨＣ、ｐＵＨＤ、ｐＵＨＥ重组质粒,其中ｐＵＨＣ含有末端片段。将ＥＤＳＶＳａｌⅠ水解产生并回收的大片段与ｐＵＨＣ在９５℃水浴中变性,６５℃复性后,用钙离子介导法,共转染５０％～７０％的单层鸭胚成纤维细胞,转染后３６ｈ开始产生细胞病变（ＣＰＥ）。４８ｈ后将病变细胞反复冻融,经尿囊腔接种９～１０日龄鸭胚,回收的尿囊液能凝集鸡红细胞,这种血凝性能被ＥＤＳＶ高免血清抑制,电镜下观察到腺病毒样颗粒。 相似文献
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新城疫病毒F48E8株核衣壳蛋白基因的克隆及其酶切分析 总被引：2，自引：0，他引：2
根据已发表的新城疫病毒（ＮＤＶ）核衣壳蛋白（ＮＰ）基因序列,设计合成１对长度为３２ｍｅｒ的引物。ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＮＤＶＦ４８Ｅ８株、Ｕｌｓｔｅｒ株、ＬａＳｏｔａ株的ＮＰ基因,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,均呈现１条长１．５ｋｂ左右的特异性带。将Ｆ４８Ｅ８株扩增产物克隆入ｐＵＣ１８载体,经限制性内切酶分析证实为ＮＰ基因。 相似文献