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1.
《中国兽医杂志》2015,(9)
通过采集疑似猪圆环病毒感染的病料,分离到1株猪圆环病毒2型贵州株,并对其进行了鉴定。原核表达试验结果表明,PCV-2贵州株的ORF2基因可在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达的目的蛋白约为40.0 k Da,且复性蛋白具有一定免疫原性。将真核表达质粒分别转染PK-15细胞,以掌握ORF2基因和白细胞介素-2(IL-2)基因体外表达情况;将重组质粒、空载体及生理盐水分别免疫BALB/c小鼠,以监测血清中特异性抗体及T淋巴细胞亚群含量,从而探讨猪圆环病毒Ⅱ型贵州分离株ORF2基因真核表达效果及长白猪细胞因子IL-2对PCV2 ORF2免疫原性的影响,结果表明,pc DNA3.1-ORF2和pc DNA3.1-ORF2-IL-2在PK-15细胞中获得了较高的表达,IL-2可明显增强PCV-2 DNA免疫效果。 相似文献
2.
根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)的核酸序列,设计了1对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪病料中扩增出了ORF3基因,将其克隆到高效真核表达载体pEGFP- N2中,筛选出含有ORF3基因的重组质粒,命名为pEGFP-N2-ORF3.对此重组质粒进行测序分析,结果表明,克隆的ORF3基因与其他PCV2的ORF3核苷酸序列相似性为96.2％-99.0％,氨基酸序列同源性为90.5 ％～98.1％.将重组质粒纯化后转染COS-7细胞,用PCR方法扩增出了特征性的基因片段,并采用特异性单抗进行间接免疫荧光,结果转染pEGFP- N2-ORF3重组蛋白在细胞核和细胞浆中均有表达,尤其在细胞核中表达量较高,且对细胞有一定的毒性.本研究为进一步探讨ORF3的结构和功能提供理论依据. 相似文献
3.
PRRSV变异株ORF6基因与IL-18共表达真核质粒的构建及其表达 总被引：1，自引：1，他引：0
针对白细胞介素18(IL-18)基因和本实验室分离的PRRSVJL/07/SW毒株全基因序列,分别设计了2对特异性引物,扩增出IL-18基因和ORF6基因。将2个目的基因克隆于真核表达载体pEGFP-N1中,成功构建了重组真核质粒pEGFP-ORF6和pEGFP-IL18-ORF6,阳性质粒转染Marc-145细胞进行筛选。通过表达载体在转染细胞中的高效转染,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)快速、准确的反映出阳性质粒在细胞质中的正确表达,再通过SDS-PAGE和Western blot鉴定构建的真核表达质粒pEGFP-IL18-ORF6的正确性。结果表明,ORF6基因和IL-18基因在Macr-145细胞中能有效表达。结论,所构建的真核质粒pEGFP-IL18-ORF6结构正确,能够在Marc-145细胞中高效表达,而且表达产物具有特异免疫学反应。 相似文献
4.
为了构建Rep蛋白真核表达质粒，研究PCV2复制过程中的亚细胞分布。本研究借助PCR方法扩增PCV2的Rep基因，并将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C3中，并转染PK15细胞和Vero细胞。结果显示，重组的pEGFP—PCV2-Rep融合蛋白能够在PK15细胞和Vero细胞中表达。结论认为pEGFP—PCV2-Rep质粒转染PK15细胞和Vero细胞后48h，PCV2的Rep蛋白主要定位在PK15细胞和Vero细胞的细胞核。 相似文献
5.
猪圆环病毒Ⅰ型ORF2蛋白序列与其核定位功能的相关性 总被引：2，自引：0，他引：2
软件分析PCV1-ORF2的核苷酸序列发现其N端的氨基酸序列中包含一段核定位序列,将具有核定位序列特征的区域删除,构建缺失核定位序列的PCV1-ORF2基因与绿色荧光蛋白的真核融合表达载体,同时构建PCV1-ORF2全基因与绿色荧光蛋白的真核融合表达载体,分别转染Hela细胞,可观察到后者绿色荧光聚集在细胞核区域;而前者转染Hela细胞结果显示核定位现象消失,从而可以推断这一区域是CPV1-ORF2蛋白核定位的功能区. 相似文献
6.
猪圆环病毒Ⅱ型Rep基因在PK15细胞中的表达及特性 总被引：3，自引：1，他引：3
为研究猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)Rep基因在PK15细胞中的表达特性，通过PCR方法克隆了PCV2杭州株(HZ0201)Rep基因全长945bp片段，与真核表达栽体pCI—neo构建为重组质粒pCI-PCV2-Rep。pCI-PCV2-Rep质粒转染PK15细胞后48h，通过RT-PCR可检测到PCV2 Rep mRNA的转录；用猪PCV2多抗血清作间接免疫荧光试验，可检测到Rep基因表达产物。在表达量低的细胞中，PCV2 Rep蛋白主要位于PK15的细胞浆，在表达量高的细胞中，细胞浆和细胞核中均含有大量的Rep蛋白，表明Rep对PK15细胞的细胞浆和细胞核的亲嗜性没有明显差别。 相似文献
7.
本研究以测序质粒为模板,扩增出结构蛋白基因ORF2a-ORF7,将此基因片段插入真核表达栽体pEGFP-N3中构建重组质粒pEGFP-N3-(ORF2a～ORF7),然后将重组表达质粒转染293T细胞.通过荧光显微镜观察显示,重组质粒pEGFP-N3-(ORF2a～ORF7)和载体pEGFP-N3均有绿色荧光出现.SDS-PAGE电泳和western blot分析结果表明重组质粒pEGFP-N3-(ORF2a～ORF7)和载体pEGFP-N3均有EGFP表达;仅ORF7有43 ku的融合蛋白EGFP出现,与预期大小相符;其他重组质粒pEGFP-N3-(ORF2a～ORF6)均没有融合蛋白出现.本实验为进一步研究这些蛋白的结构和生物学功能奠定了基础. 相似文献
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9.
猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因编码病毒的核衣壳蛋白(Cap),该蛋白属于病毒保护性抗原,具有重要免疫功能。本研究以PCV2871毒株基因组为模板,用特异性上下游引物扩增获得ORF2基因,利用真核表达载体构建了表达PCV2Cap蛋白的重组质粒pCAGGS-ORF2。采用脂质体将pCAGGS-ORF2转染至293T细胞,用抗PCV2-Cap单克隆抗体对重组质粒转染细胞进行了免疫活性分析和免疫荧光检测,表明Cap蛋白在细胞中获得表达;利用共聚焦显微镜对Cap蛋白在293T细胞中的亚细胞定位观察结果表明,转染24h后可见Cap蛋白的表达随培养时间延长显著增多,72h达到高峰,表达的Cap蛋白主要分布在细胞核中。构建的pCAGGS-ORF2真核表达重组质粒在293T细胞中的表达,为进一步PCV2基因疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
10.
猪2型圆环病毒核酸疫苗的构建、鉴定和表达 总被引：4，自引：5，他引：4
以pVAX1为真核表达载体，以猪白介素18基因、猪2型圆环病毒内蒙古株的衣壳蛋白和复制蛋白基因为目的基因，构建了pVAX1-ORF2、pVAX1-IL18-ORF2、pVAX1-ORF2-ORF1和pVAX1-IL18-ORF2-ORF1等4个重组质粒作为核酸疫苗。将这4个重组核酸质粒分别酶切鉴定后，转染BHK-21和PK-15细胞进行RT-PCR、间接免疫荧光和Western blotting检测。结果表明，重组核酸质粒构建正确，并能进行表达。 相似文献
11.
猪圆环病毒2型ORF3基因的原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
用原核表达系统表达猪圆环病毒2型ORF3基因,分析ORF3蛋白的抗原性。根据GenBank上公布的猪圆环病毒2型(PCV-2)核苷酸序列进行分析,针对ORF3基因设计并合成1对特异性引物,PCR扩增该基因,并将此片段克隆入原核表达载体pET-32a(+)上,命名为pET32a-ORF3,转化大肠杆菌Rosetta-blue(DE3) pLacⅠ感受态细胞,1.0 mmol/L IPTG 37 ℃诱导表达。结果表明,PCR扩增得到315 bp的片段,重组蛋白大小约为29 ku,与预期大小相符。Western blotting分析结果表明,重组蛋白能与抗His-tag的单克隆抗体反应,不与PCV-2阳性血清发生反应。猪圆环病毒2型ORF3基因能在大肠杆菌中成功表达,但与阳性血清之间没有反应原性,为进一步研究PCV-2 ORF3蛋白的功能及特性奠定基础。 相似文献
12.
猪圆环病毒2型ORF2-ORF1串联基因的原核表达及活性分析 总被引：3，自引：2，他引：1
为探讨原核表达的PCV-2ORF2-ORF1串联蛋白的抗原性及其作为基因工程亚单位疫苗的可能性,以构建好的PCV-2大庆分离株质粒pMD-18T/PCV-2为模板,PCR分别扩增去掉核定位信号的Cap蛋白基因(dNLS-ORF2)和Rep蛋白基因(ORF1),将其串联克隆到原核表达载体pET30a(+)上,经PCR、酶切和测序鉴定,成功构建了重组质粒pET30a-ORF2/ORF1。转化E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE电泳与Western blot分析。纯化的重组蛋白与PCV-2阳性血清发生特异性反应,并能与免疫小鼠的抗血清发生特异性反应。重组蛋白具有较好的免疫学活性,为基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
13.
根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计了1对引物,应用PCR从广西PCV-2的DNA扩增出ORF2基因,将ORF2基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )载体上,获得重组质粒,经PCR酶切以及序列分析鉴定,表明插入的片段为ORF2目的基因,插入的位置、大小和阅码框均正确,成功构建了真核表达载体重组质粒pcDNA-PCV-ORF2。对阳性真核表达质粒pcDNA-PCV-ORF2大量抽提后,以每只小鼠0.2 mg免疫5周龄左右的雌性小鼠,然后用ELISA检测免疫小鼠血清中抗体的产生情况,同时进行pcDNA-PCV-ORF2的体内分布和安全性检测。结果表明,pcDNA-PCV-ORF2在小鼠体内广泛存在,产生了抗猪圆环病毒的特异性抗体,从第7天开始产生抗体,第28天抗体水平达到最高,抗体可维持7周以上,并具有良好的安全性。本研究通过对小鼠的免疫试验,产生了猪圆环病毒的特异性抗体,表明成功构建了能够在活体细胞中高效表达的真核表达载体,为进一步研究猪圆环病毒DNA疫苗奠定了基础。 相似文献
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猪圆环病毒2型ORF2基因的表达及活性研究 总被引：1，自引：1，他引：0
根据猪圆环病毒2型(PCV-2)基因序列设计1对特异性引物,PCR扩增PCV-2去核定位信号(nuclear localization signal,NLS)的Cap蛋白基因(oRF2),经Bam H Ⅰ/HindⅢ双酶切后将其克隆到表达载体pQE30中并转化大肠埃希菌JM109,采用IPTG进行诱导表达,采用自行创新的纯化方法对表达的融合蛋白进行纯化,Western blot鉴定纯化后的重组Cap蛋白(rCap)活性.结果表明,成功克隆了无核定位信号的ORF2基因,其分子质量大小为579 bp;表达的rCap蛋白大小为24.1 ku左右,与预期大小相一致;经纯化后的rCap蛋白纯度在95%以上;Western blot鉴定结果表明,Cap蛋白可以和抗PCV-2抗体反应,具有很好的抗原性.本研究为进一步建立以Cap蛋白为包被抗原的PCV-2间接ELISA诊断方法以及PCV-2疫苗的研究奠定了基础. 相似文献
16.
对所分离鉴定的猪圆环病毒2型(PCV-2)ZZ株,参照GenBank中PCV-2全基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR扩增出PCV-2ORF2片段,原核表达载体pET-32a(+)获得重组质粒pET-ORF2,IPTG进行诱导表述,并进行Western blot分析。结果表明,PCR扩增产物长度为702bp,大小与预期的一致,成功构建重组质粒,经IPTG诱导成功获得分子质量约为30ku的表达蛋白,该蛋白具有很好的免疫原性,为进一步研制PCV-2疫苗提供依据。 相似文献
17.
PRRSV NC株ORF3基因的克隆、序列分析及表达 总被引：1，自引：0，他引：1
为原核表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF3基因,本研究根据GenBank登录PRRSV美洲株ATCC VR2332的ORF3基因序列,利用Primer 6.0软件设计合成一对特异性引物,经RT-PCR扩增得到了大小为765bp的片段。将扩增的ORF3基因截短为495bp和750bp片段分别克隆于原核表达载体pGEX-KG中,在IPTG的诱导下进行Gp3重组蛋白的截短表达,经western blot检测证实表达的2种截短重组蛋白均具有良好的与抗体的反应活性,从而为进一步研制新型疫苗提供了实验依据。 相似文献
18.
本试验采用PCR方法扩增出完整的PCV2 ORF2基因,并将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1TM中,获得重组转移载体pFast-ORF2,再将其转化DH10Bac感受态细胞,发生转座反应,通过抗性及蓝白斑筛选获得含有ORF2基因的重组杆粒,通过Cellfectin转染试剂介导将重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。用该重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,并通过间接免疫荧光法和Western blotting检测目的蛋白的表达。结果表明,ORF2基因在昆虫细胞中获得表达,表达的蛋白质可被PCV2阳性血清识别,这为进一步研究PCV2亚单位疫苗及诊断抗原奠定了基础。 相似文献
19.
为研究猪肾细胞系PK-15中Beta 2微球蛋白（Beta 2 microglobulin，β2m）基因的表达情况，提取细胞总RNA，经RT-PCR扩增β2m。回收后的基因克隆至pMD18-T载体，获得重组质粒，经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切筛选后，阳性克隆送生物公司测序。序列经GENETYX version 9.0编辑分析，通过DNAMAN version 5.2.2与其他猪β2m基因进行序列比对分析，利用Mega 5.0的NJ法进一步分析其与其他物种β2m的分子进化关系，并在此基础上利用SWISS-MODEL和PDBsum预测该基因编码的成熟肽二级结构和三级结构。提取PK-15总蛋白，Western blotting检测和分析细胞中β2m的表达。结果显示，经RT-PCR扩增，成功获得β2m条带，大小约360 bp。经测序发现PK-15-β2m基因为364 bp，共编码118个氨基酸，其中成熟肽为98个氨基酸，N端信号肽含有20个氨基酸。序列分析证实PK-15细胞中β2m基因未发生突变；分子进化分析显示，PK-15-β2m与牛的亲缘关系最近，其次为羊、马等。多重序列比对发现，PK-15-β2m与牛、羊、马β2m成熟肽均为98个氨基酸，而其他物种β2m成熟肽为99个氨基酸；二级结构预测显示，PK-15-β2m成熟肽主要以β-折叠、β-转角和γ-转角为主，不含有α-螺旋。三级结构预测显示，PK-15-β2m成熟肽主要由7条β-折叠条带构成。Western blotting分析显示β2m在细胞中成功表达。本研究证实了猪肾细胞系PK-15中β2m在核酸和蛋白质水平均稳定表达，为下一步研究PK-15细胞的抗原递呈功能奠定了基础。 相似文献
20.
以猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）WH株基因组DNA为模板,扩增ORF2截短基因,经BamH I/NotI双酶切处理后与经相同酶切处理的pET32a（＋）原核表达载体连接,获得重组质粒pET32a-Cap2。将重组质粒转化至BL21（DE3）,经IPTG诱导,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。纯化的重组蛋白免疫小鼠,并对获得的血清进行间接ELISA检测和中和活性测定。SDS-PAGE分析表明,ORF2截短基因在大肠杆菌中得到表达,蛋白分子质量大小为40 kDa,重组PCV2 Cap蛋白主要以上清的形式存在。Western blot证实重组蛋白能够识别抗PCV2阳性血清。经间接ELISA检测,鼠抗PCV2 Cap血清抗体效价能达到1：25 600,间接免疫荧光检测分析表明,鼠抗PCV2 Cap血清能特异性识别PCV2感染细胞中的Cap蛋白。病毒血清中和实验证实,抗PCV2 Cap血清抗体具有中和病毒的活性,中和效价为1：36。猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达,为进一步研究该蛋白的功能及Cap蛋白亚单位疫苗和检测试剂盒的制备奠定了基础。 相似文献