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《中国预防兽医学报》2021,(4)
为了筛选与H5、H7亚型流感病毒HA蛋白互作的宿主膜蛋白,本研究根据H7亚型流感病毒AH1株与H5亚型流感病毒FJ1160株的HA基因序列设计引物,分别PCR扩增两株流感病毒的HA基因,连接至pCAGGS载体,分别构建了H5、H7亚型流感病毒模式病毒株的HA蛋白真核表达质粒pCAGGS-HA-AH1与pCAGGS-HAFJ1660。将pCAGGS-HA-AH1、pCAGGS-HA-FJ1660分别转染HEK-293T细胞,经培养后提取细胞膜蛋白,利用免疫沉淀(IP)试验筛选与HA蛋白互作的宿主膜蛋白。质谱(shotgun)分析结果显示,有35种宿主膜蛋白同时与H5、H7亚型流感病毒HA蛋白存在相互作用。进一步进行基因本体论(GO)分析,结果显示这35个候选膜蛋白主要作为细胞膜及细胞器膜的组分与其他蛋白或离子结合,以介导生物调控及代谢等过程。为了验证筛选结果的可靠性,利用qPCR对代表性基因ATPAP2、DYNLL1、 RAB7A进行检测,结果显示代表性基因ATPAP2、DYNLL1、RAB7A在293T细胞中均有表达,与预测相符。本研究首次筛选得到与两种亚型流感病毒HA蛋白同时存在相互作用的宿主膜蛋白,为进一步对宿主蛋白与流感病毒HA蛋白相互作用机制的研究提供基础数据。 相似文献
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《上海畜牧兽医通讯》2018,(6)
流感病毒变异迅速,为研究和建立一种针对H5 N8亚型流感病毒核酸准确灵敏的检测方法,分别选择H5 N8亚型流感毒株序列相对保守的HA基因和NA基因作为H5 N8亚型流感病毒检测的靶序列,设计两套特异性的引物和探针,选择两种不同的荧光标记,建立基于TaqMan探针的双重荧光RT-PCR快速检测H5 N8亚型禽流感病毒检测方法。实验结果表明,所建立的H5 N8亚型流感病毒real time RT-PCR检测方法 HA基因检测的灵敏度为10-5,NA基因检测的灵敏度为10-5,重复性好,特异性佳。结果表明:本研究建立的双重荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地检测H5 N8亚型流感病毒,耗时短,可很快作出判定结果,适用于H5 N8流感病毒的分子生物学检测和监测。对于控制流感流行,减少经济损失,最大限度保护社会人群健康具有很大意义。 相似文献
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《上海畜牧兽医通讯》2017,(3)
为研制H5N6亚型流感病毒核酸快速检测试剂盒,选择H5N6亚型流感毒株序列相对最保守的HA基因和NA基因作为H5N6检测的靶序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针的双重荧光RT-PCR快速检测H5N6亚型禽流感病毒的方法。实验结果表明,所建立的H5N6亚型流感病毒real time RT-PCR检测方法 HA基因检测的灵敏度为10~(-5),NA基因检测的灵敏度为10~(-4),重复性良好,特异性佳。结论:本研究建立的双重荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地检测H5N6亚型流感病毒。 相似文献
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为研究2015年人感染H7N9流感病毒血凝素基因变化带来的病毒感染力、致病力等特征变化,从GISAID和GenBank上获取我国2015年人感染H7N9流感病毒HA核酸序列,经BLAST在线比对后下载选用的2013年和2014年人、家禽感染H7N9流感病毒HA核酸序列;利用MEGA6.0分析HA蛋白关键位点氨基酸残基的变化,比较HA核苷酸序列同源性,构建系统进化树,探讨我国2015年人感染H7N9流感病毒HA基因变化和引起的病毒感染力、致病力变化。2015年人感染H7N9病毒HA蛋白均具有能使其与人呼吸道受体特异性结合的Q226L,各样本HA蛋白氨基酸替换位点比2013年样本氨基酸替换位点增多,2015年人感染H7N9病毒出现分化。新增的氨基酸变化可能加强了H7N9病毒对人的毒力,2015年人感染H7N9病毒出现分化并具有地域性特征。 相似文献
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为了解H5N3亚型流感病毒的生物学特性,本研究对2017年浙江省分离到的一株H5N3亚型禽流感病毒(AIV)[DK/ZJ/S1368/2017(H5N3)]进行了遗传演化分析及小鼠感染性实验。遗传演化分析结果显示,该株病毒的HA蛋白裂解位点处仅含一个碱性氨基酸,属于低致病性AIV。同时,该病毒的血凝素(HA)基因与H5N7亚型流感病毒亲缘关系较近;聚合酶碱性蛋白2(PB2)基因和核蛋白(NP)基因与H10N7亚型流感病毒亲缘关系较近;碱性聚合酶蛋白1(PB1)基因与H1N1亚型流感病毒亲缘关系较近;酸性聚合酶蛋白(PA)基因与H6N2亚型流感病毒亲缘关系较近;神经氨酸酶(NA)基因与H10N3亚型流感病毒亲缘关系较近;基质蛋白(M)基因与H3N8亚型流感病毒亲缘关系较近;非结构蛋白(NS)基因与H1N1亚型流感病毒亲缘关系较近。表明其基因来源复杂。小鼠感染实验结果显示,该分离株无需提前适应即可以在小鼠肺脏和鼻甲中复制,小鼠感染病毒后无明显临床症状,与对照组相比其体质量变化不明显,表明该病毒对小鼠呈低致病性。本研究通过对该H5N3亚型AIV的生物学特性的分析,发现该病毒基因来源复杂,无需提前适应就可以在小鼠体内复制,具有感染哺乳动物的潜在威胁,提示应当持续加强对H5N3亚型AIV的监测和相关生物学特性的研究工作。 相似文献
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为明确高致病性和低致病性H7N9亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白的血清学特性是否有差异,通过体外表达两种H7N9亚型流感病毒HA蛋白并进行分析。利用RT-PCR方法扩增出高、低致病性H7N9亚型流感病毒HA基因,测序,并克隆于真核表达载体pCAGGS-Flag中,构建两个重组表达质粒,命名为pCAF-H7HPHA和pCAF-H7LPHA,分别转染293T细胞,用间接免疫荧光试验和Western blot试验观察HA蛋白的表达情况。结果显示:与低致病H7N9亚型流感病毒比较,高致病性H7N9亚型流感病毒HA基因裂解位点有连续的碱性氨基酸插入,糖基化位点和受体结合位点没有差异。不同致病性毒株的HA蛋白均能表达良好,表达蛋白分子量约为70 ku;高致病性H7N9亚型流感病毒HA蛋白(或血清)可以与低致病H7N9流感血清(或蛋白)发生反应。结果表明:不同致病性H7N9亚型流感病毒HA蛋白在血清学上没有差异性,为H7N9亚型流感病毒HA蛋白的研究奠定基础。 相似文献
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从湖南分离得到一株H5N1亚型禽流感病毒(AIV),首先设计合成两对HA和NA基因特异性引物,采用两步法RT-PCR,对鸭流感病毒株 A/Duck/HunanWugang/2/2004(H5N1)(简称DK/HNWG/2/04)的表面蛋白基因进行序列测定,并与国内外已经发表的H5N1亚型毒株表面蛋白基因进行序列分析和比较.结果表明,HA和NA基因全长分别约为1.7 kb和1.4 kb,分离株与14个参考毒株HA基因的同源性为95.9%～98.0%,NA基因的同源性为87.0%～98.4%.根据HA基因核苷酸序列推导HA裂解位点氨基酸,发现分离株的裂解位点包含多个碱性氨基酸,符合高致病性禽流感的特征. 相似文献
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为获得重组表达的H5亚型流感病毒血凝素(HA1)抗原.将PCR扩增的H5亚型流感病毒HA1基因克隆到原核表达载体pET-28a,构建重组原核表达质粒pETHA1-H5.结果显示,转化pETHA1-H5的大肠杆菌BL21(DE3)在IPTG的诱导下以包涵体形式表达了HA1蛋白.HA1重组蛋白能与不同禽类(鸡、鸭和鹅)H5亚型流感病毒阳性血清发生特异性反应,同时以HA1重组蛋白为抗原制备的单克隆抗体具有与H5亚型完整病毒粒子抗原反应的能力,说明重组表达的HA1蛋白保留了自然条件下H5亚型流感病毒的抗原特征.将重组表达的HA1蛋白作为ELISA抗原检测禽血清中的H5亚型流感病毒抗体,以HI试验结果为参考,两者的符合率为96.6%,证明HA1重组蛋白作为ELISA检测抗原是可行的. 相似文献
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目前流行的甲型H1N1流感病毒是一个复杂的基因重配病毒。对病毒的分子生物学研究,尤其是病毒囊膜蛋白血凝素（haemagglutini,HA）基因和神经氨酸酶（neuraminidase,NA）基因的研究,为控制和预防H1N1流感病毒具有重要的意义。本研究对中国流行的2009甲型H1N1猪源流感病毒的HA和NA基因与疫苗株A/California/07/2009（H1N1）,以及不同国家和地区的病毒株进行核苷酸和氨基酸序列分析。从NCBI的GenBank数据库下载所需要毒株的序列,采用Lasergene 6.0软件包中的EditSeq和MegAlign进行序列分析,进化树分析采用MEGA4.1软件。进化分析表明,中国流行的2009 H1N1流感病毒与疫苗株的核苷酸同源率分别在98.8%~99.7%和98.6%~99.6%之间;裂解位点处为I/VPSIQSR↓G,不具备高致病性流感病毒的特征;有1株NA抗性病毒。尽管与疫苗株相比,中国流行株2009甲型H1N1猪源流感病毒的HA和NA基因有部分突变,但这些突变并不是重要的。本研究首次详细分析了中国流行的2009甲型H1N1猪源流感病毒株与疫苗株的HA和NA基因的分子特征,对实时监测流感病毒HA和NA基因的变化具有重要意义。 相似文献
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1株野禽源H5N6亚型禽流感病毒的分离鉴定与遗传进化分析 总被引：1，自引：0，他引：1
《中国兽医杂志》2017,(5)
为了解野生鸟类禽流感病毒的流行情况,对2015-2016年广州地区野生鸟类进行流感监测,分离得到1株H5N6流感病毒。对病毒分离株进行基因克隆、测序和序列分析,结果显示,HA基因属于Clade2.3.4.4,HA蛋白的裂解位点处具有多个连续碱性氨基酸,具备高致病性禽流感病毒的典型分子特征。各基因片段分别与H5N6亚型的猫和家禽等的不同宿主病毒株相应片段具有较高相似性,揭示了野鸟作为流感病毒孵化器的可能性,提示需加强对野生鸟类禽流感监控。 相似文献
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来自香港和世界各地的10株宠物鸟H3N8流感病毒的HA基因进行了全基因序列测定,用DNASTAR和Tree-View软件进行序列编辑,序列翻译,进化树绘制和分子演化分析.结果表明来自不同国家和地区的H3N8流感病毒的HA基因都非常相似,都形成一个独立的分支,属于欧亚亚系,同源率为95.9%～100%;香港2001年宠物鸟的毒株之间的同源率最高,分别为99.2%～100%.HA基因与A/Equine/Jilin/89(H3N8)的同源性为最高,在92.9%～93.6%之间.氨基酸分析表明只有A/Parakeet/Netherland/33/01的HA基因在97～99受体结合位点处有一个额外潜在的糖基化位点NKT;因此可见宠物鸟H3N8流感病毒的HA基因高度保守,HA基因均来自共同的祖先. 相似文献
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为了分析2013年新型重配甲型H7N9流感病毒HA基因分子流行病学特征,从NCBI数据库下载不同分离宿主的流感毒株HA全基因序列,应用分子生物学软件进行遗传演化分析。结果显示:A/Hangzhou/1/2013(H7N9)株HA裂解位点为PEIPKGR↓GLF,含有2个碱性氨基酸;HA蛋白有糖基化位点5个。抗原位点和受体结合位点,相对于之前人感染的H7亚型流感病毒发生不同程度变化。与A/Hangzhou/1/2013(H7N9)株中HA片段的核苷酸同源率较高的前10个毒株均分离自亚洲国家禽类,同源率达到95%以上。此次新型重配H7N9流感毒株HA基因是否由禽传给人有待进一步研究。 相似文献
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A型流感病毒（AIV）引起的禽类禽流行性感冒（avian influenza,AI）或相关疾病,被国际兽疫局定为甲类传染病。AIV中最容易突变的基因是血凝素（HA）基因,具有亚型和株的特异性,是区分病毒亚型的依据之一。本研究从GenBank中下载了所有209条鸭源H5禽流感病毒HA基因的全序列,利用生物信息学软件构建进化树研究序列的聚类特点;比较不同年份毒株的HA基因的受体结合位点氨基酸,找出受体结合位点氨基酸的变异规律;比较不同年份分离的鸭源H5N1序列的HA1和HA2蛋白的剪切位点,找出各年份毒株的剪切位点的特点;比较不同年份分离序列的潜在糖基化位点,统计各年份潜在糖基化位点的数量以及序列变化。期望找到H5亚型鸭源流感病毒的变异规律和变异方向,为鸭源流感的防控起到积极的作用。 相似文献
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G57基因型H9N2亚型流感病毒是当前威胁我国养禽业健康发展的重要病原。该病毒的免疫逃逸机制是值得探究的科学问题。本研究利用反向遗传技术拯救了5株具有不同血凝素(hemagglutinin, HA)糖基化模式的病毒。基于交叉血凝抑制结果绘制的抗原图谱显示，这5株病毒存在明显的抗原差异。这种差异与HA上的第21,210,289,304位糖基化位点直接相关，其对病毒抗原性的影响由大到小依次为304,210,289,21位糖基化位点。结果表明，HA糖链可能影响其周围的抗原表位的暴露程度，进而影响抗体与HA的结合，致使具有不同HA糖基化模式的病毒表现出抗原差异。因此，加强对流感病毒位点特异性糖基化的认识，从而更加准确地辨析HA糖基化与抗原距离的关系，对预测特定毒株的免疫逃逸能力以及疫苗的设计提供了依据。 相似文献
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猪流感病毒H1N1广东分离株HA基因的克隆与进化分析 总被引：1，自引：1，他引：0
采用常规的血清学试验和特异性RT-PCR,从广东不同地区猪场分离鉴定出8株H1N1亚型猪流感病毒(SIV)。用流感病毒血凝素(HA)基因通用引物扩增了8株病毒的血凝素(HA)基因,经克隆测序,HA基因全长1 757 bp,编码566个氨基酸。8个毒株的HA基因推导氨基酸序列分析表明,均含有8个潜在的N糖基化位点,且糖基化位点相同,其HA1、HA2之间切割位点序列为IPSIQSR↓G,从分子水平推论,此8株H1N1 SIV均属于非高致病性毒株。同源性分析表明,此8株病毒的氨基酸序列与经典SIV之间的同源性在92.3%~94.7%之间;与2009年甲型H1N1流感病毒同源性在80.4%~92.4%之间;与欧洲类禽SIV分离株同源性在80.4%~84.1%之间。进化关系表明,该8株SIV与A-swine-Shanghai-3-2005-H1N1同处一分支,与2009年甲型H1N1流感病毒和经典SIV分离株亲缘关系较近,与欧洲类禽SIV分离株亲缘关系较远。 相似文献
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从广东省不同猪场分离到4株H3N2亚型猪源流感病毒A/Swine/Guangdong/01/2004、A/Swine/Guang-dong/02/2004、A/Swine/Guangdong/03/2004、A/Swine/Guangdong/04/2004.根据GenBank公布的H3N2亚型猪源流感病毒的HA基因序列,设计1对引物,运用RT-PCR方法扩增四株病毒的HA基因,并进行测序和分析.同源性分析和遗传进化分析表明本实验的4株H3N2亚型SIV HA基因核苷酸序列同源性为99.8%～99.9%,在遗传进化树中均位于同一分支上.与参考毒株的比较分析表明,4个毒株与WHO推荐的2001-2004年北半球H3N2亚型流感疫苗株A/Moscow/10/99 HA基因的核苷酸序列同源性最高为99.4%～99.5%,4个毒株与A/Moscow/10/99 HA基因在遗传进化树中位于同一个小分支上.氨基酸序列比较发现,4个毒株HA基因裂解位点处的氨基酸序列均为PEKQTR↓G,4个毒株推导的氨基酸序列中均有11个糖基化位点,4个毒株HA蛋白226位受体结合位点(RBS)处氨基酸均为异亮氨酸(Ⅰ).4个毒株HA基因的氨基酸序列、受体结合位点以及糖基化位点均与A/Moscow/10/99相应的氨基酸序列一致.本试验的4株H3N2亚型猪源流感病毒的HA基因属于以A/Moscow/10/99为代表的近代类人H3N2亚型流感病毒,在一定程度上揭示了广东省H3N2亚型猪流感病毒HA基因进化与流行情况. 相似文献