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通过将鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of Carp Virus,SVCV)糖蛋白(Glycoprotein,G)基因截短后构建重组表达载体,实现体外高效表达G蛋白,为有关原核诱导蛋白提供参考。以质粒pEGFP-G为模板设计引物,分别扩增G基因的不同片段,与密码子优化后的G基因分别插入pET-32a表达载体,构建重组表达载体pET-32a-GX和pET-32a-OG。经过鉴定后,将重组质粒分别转入大肠杆菌BL21(DE3),通过适宜条件的诱导表达,获得诱导产物并进行SDS-PAGE和Western blotting检测。构建了重组表达载体pET-32a-GX与含密码子优化后G基因的重组表达载体pET-32a-OG;经适宜条件诱导表达了G蛋白后的SDS-PAGE和Western Blotting检测,表明G蛋白成功表达,且含截短片段的重组载体pET-32a-G2的蛋白表达量最高,与原G序列有相同的免疫原性。成功构建截短后的原核表达载体pET-32aGX与密码子优化后的重组表达载体pET-32a-GX,并实现体外大量诱导SVCV的G蛋白。 相似文献
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构建致倦库蚊(贵阳株)天蚕素B2(CecB2)基因原核表达载体,并原核表达获得重组蛋白。定向克隆CecB2成熟肽序列至原核表达载体pET32a(+)上,将成功构建的pET32a-CecB2重组表达质粒转化大肠埃希菌Rosetta中经IPTG诱导表达,对IPTG诱导浓度和诱导时间优化后表达所得目的蛋白采用镍离子亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blot检测鉴定表达蛋白。结果表明,成功构建原核表达载体pET32a-CecB2,IPTG浓度和时间优化结果为IPTG浓度为0.05mmol/L,诱导时间为3h。SDS-PAGE检测获得大小约25ku的可溶性纯化蛋白,Western blot鉴定纯化蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生抗原抗体结合反应。说明所构建原核表达载体pET32a-CecB2能在大肠埃希菌中可溶表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。 相似文献
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本实验以新疆哈萨克羊睾丸组织为实验材料,提取组织总RNA,经反转录得到c DNA并以此为模板,用以Gen Bank(NM_001308579.1)序列为参考设计的特异性引物进行PCR扩增,之后将扩增产物与p ET32a(+)载体相连,构建重组质粒p ET32a(+)-INHα。将构建好的重组质粒转化到受体菌E.coli BL21中,经IPTG诱导,表达p ET32a(+)-INHα重组蛋白。对扩增产物的测序鉴定结果显示INHα基因克隆成功;经过酶切和测序鉴定确定准确构建了p ET32a(+)-INHα重组载体;经Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定,检测到INHα基因编码区全序列表达的重组蛋白单一条带,这说明原核表达载体构建成功并在原核细胞中正常表达,这为今后绵羊INHα基因的免疫功能研究提供了参考依据。 相似文献
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试验旨在通过基因工程方法获得重组猪SLA-DRB蛋白。根据基因库猪SLA-DRB基因序列设计合成特异性引物,引物两端分别加上BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点及保护碱基;提取长白猪肠系淋巴结RNA,用RT-PCR的方法扩增猪SLA-DRB基因cDNA,并将其克隆到pMD18-T载体上,测序后经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆到pET-32a( )中,构建原核表达载体pET-32a-DRB;将重组表达质粒转化至宿主菌Rosseta中,诱导表达。结果表明,成功扩增出猪SLA-DRB基因cD-NA,经DNA序列测定,所得基因与国外报道的序列99.9%相同;成功构建原核表达载体pET-32a-DRB;经IPTG诱导,表达出了6×His-DRB融合蛋白,对表达的蛋白用SDS-PAGE电泳分析,得到了约50kDa左右蛋白,与预期大小相符,表明猪SLA-DRB基因在大肠杆菌中成功的进行了表达。 相似文献
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猪传染性胃肠炎病毒S基因B、C位点的克隆及原核表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
参考GenBank上公布的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）S基因B、C抗原位点序列,应用Primer6．0设计一对含酶切住点的引物,用于RT—PCR扩增B、C抗原位点目的片段,将扩增产物连接于peasy—T克隆载体上,构建克隆载体,用EcoRⅠ和XhoⅠ对表达载体PET-32a（＋）和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a（＋）多克隆位点上,连接、转化至BL21（DE3）,构建B、C位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。所扩增的目的片段的大小为357bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其他猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEVS基因B、C抗原位点的原核表达载体。TGEVS基因B、C抗原位点原核表达载体的成功构建,为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。 相似文献
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为构建乙型脑炎病毒(JEV)SXBJ07株E基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行高效表达;根据JEV SXBJ07株基因组全序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增E基因全长;将目的基因插入pGEM-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET32α中,再转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后对其产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。结果表明:扩增到了全长为1 500 bp的JEV SXBJ株E蛋白基因;重组质粒pET-32α-E构建成功;融合蛋白可以与乙脑阳性血清抗体特异性结合。说明在大肠杆菌中成功表达了JEV E蛋白。 相似文献
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新型抗菌肽Hadrurin基因的克隆与表达 总被引：1，自引：1，他引：0
Hadrurin是一种分离自毒蝎的高活性抗菌肽,对多种细菌有较强抑制活性.本试验构建Hadrurin全基因并在其两端加入了可切除的保护性多肽基因;再酶切Hadrurin基因产生黏性末端并连入pET-32a(+)原核表达载体;IPTG诱导表达抗菌肽蛋白,亲和层析纯化抗菌肽蛋白.结果表明,构建的Hadrurin全基因片段序列完全正确,连接进入pET-32a(+)表达载体的基因由0.1 mmol/L终浓度的IPTG诱导5 h可达到表达的高峰,重组蛋白经亲和层析可到达纯化的目的. 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(7):1178-1182
用real-time PCR方法扩增家兔PepTⅠmRNA序列,通过原核表达体外获得家兔PepTⅠ蛋白,旨在制备多克隆抗体。试验通过RT-PCR方法成功扩增出2 001bp的家兔PepTI基因片段,设计特异性引物成功扩增出抗原表位相对集中的1 071bp大小的片段,构建重组表达质粒,获得融合蛋白。结果显示:家兔PepTⅠ基因片段成功的连接到pMD18-T载体上,重组克隆载体双酶切后回收目的片段分别连接到原核表达载体pET-32a、pET-28a,经转化提取质粒测序验证后表明,成功构建原核表达载体pET-32a-P、pET-28a-P,将重组质粒转化至感受态细胞BL21(DE3)后IPTG诱导,成功表达出PepTⅠ融合蛋白,目的蛋白相对分子质量大小约为44 000,与预期试验结果相符。结果表明:本试验成功扩增出家兔PepTⅠmRNA序列,并且通过原核表达获得家兔PepTI融合蛋白。 相似文献
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猪瘟病毒贵州流行株E2基因原核表达及其免疫原性的研究 总被引：4，自引：1，他引：3
本研究根据GenBank登录的猪瘟病毒Shimen和C株的E2基因序列设计1对特异引物,采集来自贵州的疑似猪瘟病死猪组织,提取总RNA,进行RT-PCR扩增,将扩增产物测序后进行核苷酸序列比较分析.并将RTPCR产物克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒pMD18-T-E2,经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后,将E2基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,成功构建猪瘟病毒E2基因原核表达质粒pET-32a-E2,将构建好的原核表达质粒pET-32a-E2转化至宿主菌BL21中,诱导表达目的蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳、Western blot分析,得到了约58 ku的条带,与预期大小相符,进一步提取、纯化目的蛋白,将目的蛋白加入弗氏佐剂免疫小鼠,免疫后采血检测抗体,结果显示目的蛋白能诱导小鼠产生一定抗体水平,该研究为猪瘟亚单位疫苗的研究奠定了基础. 相似文献
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针对绵羊Myostatin基因特异性序列,设计4对shRNA,并合成高表达载体。将干扰质粒和高表达载体瞬时共转染HEK293细胞,应用Real-time PCR鉴定干扰效率,将筛选到最有效的shRNA表达载体和pDONR221载体进行BP重组反应,以获得含干扰序列的入门载体。然后将含干扰序列的入门载体和慢病毒表达的目的载体pLenti6/BLOCK-iT-DEST进行LR重组反应,以获得含干扰序列的慢病毒表达载体。qPCR检测病毒物理滴度。结果本试验成功构建绵羊Myostatin基因RNAi慢病毒载体,病毒的滴度为：9.3×109 TU/mL。为研究Myostatin基因对肌肉生长的影响提供了稳定感染细胞载体。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2017,(1)
为了探索略阳乌鸡α干扰素在大肠杆菌中高效表达的诱导条件,试验采用PCR获得略阳乌鸡α干扰素成熟肽段的编码区DNA序列,将其克隆至载体p ET-32a的HindⅢ和XhoⅠ位点间,并通过菌落PCR和测序鉴定获得的鸡α干扰素的原核表达载体p ET-32a-Ch IFN-α。将p ET-32a-Ch IFN-α转化至大肠杆菌Rosetta菌株,通过筛选获得阳性克隆,进而分别对诱导表达时间、诱导剂浓度等条件进行筛选,获得了略阳乌鸡α干扰素的最佳表达条件。结果表明:成功构建p ET32aCh IFN-α质粒和重组菌株,最适诱导表达条件为诱导温度37℃,诱导剂IPTG浓度0.2 mmol/L,诱导时间5 h,诱导时机OD600值为0.448时。说明构建略阳乌鸡α干扰素的原核表达菌株成功,并且实现了α干扰素的高效表达。 相似文献
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通过电子克隆手段,克隆到大小为959bp的cDNA序列。然后从鸡的脾脏提取RNA,用RT-PCR方法扩增出目的片段。将该片段连接到原核表达载体pET-32a和真核表达载体pEGFP-C1中,采用SDS-PAGE检测原核表达载体pET-BCL10在大肠杆菌中的表达,脂质体转染法将真核表达载体pEGFP-BCL10转入vero细胞,Western blotting检测其在细胞中的表达。结果显示,PCR扩增到735bp的DNA片段,原核表达载体和真核表达载体经双酶切和核酸测序表明载体构建成功。SDS-PAGE电泳检测到pET-BCL10重组质粒在大肠杆菌中表达。Western blotting检测到pEGFP-BCL10重组质粒在vero细胞中表达。结论表明,BCL10基因在鸡体内存在,该基因的重组质粒能在大肠杆菌和vero细胞中表达。 相似文献
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中内毒素(LPS)诱导后家蝇幼虫抗菌肽Cec Md基因的克隆、生物信息学分析及其表达载体的构建(英文) 总被引：1，自引：0，他引：1
从脂多糖(LPS)诱导或非诱导的家蝇幼虫体内抽提总RNA,根据家蝇Cecropin基因(GenBank:DQ 232774)设计特异性引物,应用RT-PCR技术扩增出编码CecMd开放阅读框(ORF)的cDNA序列,将其克隆入pMD18-T载体,经PCR、双酶切和测序鉴定正确后,将CecMd亚克隆基因与线性化的pET32a(+)连接,构建重组表达载体pET32a(+)/CecMd,并对此基因及其推导氨基酸序列进行系统的生物信息学分析。结果表明从脂多糖(LPS)诱导的家蝇幼虫体内成功的扩增出家蝇抗菌肽Cecropin基因,命名为CecMd,但是从未诱导的虫体内未能获得此基因;CecMd开放阅读框的cDNA全长为192 bp,编码由63个氨基酸残基组成的多肽;此多肽最可能的裂解位点在氨基酸残基A23和G24之间,提示1~23氨基酸残基组成信号肽,24~63氨基酸残基构成成熟肽;CecMd的全长肽包含4个螺旋,成熟肽(不包括信号肽)含有2个螺旋,两者均不含二硫键;CecMd与果蝇Cecropins的同源性显著高于其他昆虫,达到81.0%以上;经PCR,限制酶切和DNA测序鉴定表明,成功构建了重组表达载体pET32a(+)/CecMd。重组表达载体pET32a(+)/CecMd的构建及其CecMd基因的生物信息学分析对其生物学功能研究和高效表达工程菌的构建具有重要意义。 相似文献
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为获得猪骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(skeletal muscle myosin light chain kinase,skMLCK)基因全长cDNA序列,构建猪skMLCK基因的真核表达载体,参考GenBank预测信息并利用Primer Premier 5.0和DNAMAN生物学软件,分2段进行RT-PCR扩增,进行猪skMLCK基因的cDNA全长克隆、测序、拼接、合成,构建猪skMLCK基因的真核表达载体。结果获得了猪skMLCK基因的全长cDNA序列,序列长度为1 851 bp。成功构建了猪skMLCK基因的真核表达载体,重组质粒为pEGFP-N1-skMLCK。猪skMLCK基因全长cDNA的测序和真核表达载体的构建为进一步研究猪skMLCK基因在肌纤维生长发育中的作用奠定基础,为通过基因水平来改善与评价猪肉质性状提出了一个新方向。 相似文献
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从脂多糖（LPS）诱导或非诱导的家蝇幼虫体内抽提总RNA,根据家蝇Cecropin基因（GenBank：DQ 232774）设计特异性引物,应用RT—PCR技术扩增出编码CecMd开放阅读框（ORF）的eDNA序列,将其克隆入pMD18-T载体,经PCR、双酶切和测序鉴定正确后,将CecMd亚克隆基因与线性化的pET32a（＋）连接,构建重组表达载体pET32a（＋）／CecMid,并对此基因及其推导氨基酸序列进行系统的生物信息学分析。结果表明从脂多糖（LPS）诱导的家蝇幼虫体内成功的扩增出家蝇抗菌肽Cecropin基因,命名为CecMd,但是从未诱导的虫体内未能获得此基因;CecMd开放阅读框的cDNA全长为192bp,编码由63个氨基酸残基组成的多肽;此多肽最可能的裂解位点在氨基酸残基A23和G24之间,提示1～23氨基酸残基组成信号肽,24～63氨基酸残基构成成熟肽;CecMd的全长肽包含4个螺旋,成熟肽（不包括信号肽）含有2个螺旋,两者均不合二硫键;CecMd与果蝇Cecropins的同源性显著高于其他昆虫,达到81．0％以上;经PCR,限制酶切和DNA测序鉴定表明,成功构建了重组表达载体pET32a（＋）／Cec Md 。重组表达载体pET32a（＋）／Cec Md的构建及其CecMd基因的生物信息学分析对其生物学功能研究和高效表达工程菌的构建具有重要意义。 相似文献
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FMDV结构基因P1的克隆与植物双元表达载体的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
通过RT-PCR法获得阿克苏(Akesu/O/58)FMDV结构基因P1,将该基因克隆到pGEM-T Easy载体进行核苷酸序列测定。将P1基因、Kozak序列等插入中间表达质粒pB in438,构建重组中间表达载体pB inP1。采用三亲融合法构建植物双元表达载体pB inFMDV-P1。结果表明:P1基因为2 208 bp。重组中间表达载体pB inP1经BamHⅠ/SalⅠ双酶切、PCR扩增和序列测定,表明P1基因、Kozak序列等已插入pB inP1。在含50mg/L卡那霉素、25 mg/L链霉素和50 mg/L利福平的YEB培养基上筛选及对融合农杆菌质粒进行P1基因的PCR检测,证明植物双元表达载体pB inFMDV-P1构建正确。 相似文献